蜡梅(Chimonanthus praecox(Linn.) Link)，蜡梅科(Calycanthaceae)蜡梅属(ChimonanthusLindl.)木本植物，原产于我国。其冬季开花色泽金黄并带有香味，是名贵的木本切花。但在蜡梅切枝采收以及贮藏运输过程中容易落蕾落花，尤其是中蕾期花蕾的脱落直接影响了蜡梅作为鲜切花的开发应用。以往关于蜡梅切花保鲜的研究基本停留在生理生化水平，而且缺少对落蕾问题的专门研究。 近些年研究发现，扩张蛋白与器官脱落关系密切。2009年，我们在蜡梅的研究中分离得到CpEXP1基因(GeneBank accession no.JN700522)，序列分析及同源性比较发现该基因属于α-扩张蛋白基因。但该基因的功能尚未明确。如果该基因的表达与蜡梅花蕾脱落存在相关性，我们就可以考虑通过调控该基因的表达来进一步深入探索蜡梅花蕾脱落的机理，为寻找抑制蜡梅花蕾脱落的措施提供新思路。 本研究以素心蜡梅（Ch.praecox var.concolor Makino）为材料，在克隆CpEXP1基因的基础上进行了原核表达和重组蛋白活性分析;并对不同组织、不同开花阶段中CpEXP1基因的表达进行了研究;在花蕾脱落力分级的基础上对蜡梅花梗离层形成解剖结构、CpEXP1基因的表达以及扩张蛋白活性的相关性进行了分析;通过构建植物表达载体并转化拟南芥，对该基因的其它功能进行了鉴定。最后，对CpEXP1基因启动子进行了克隆和功能分析。主要结果如下: (1)原核表达及其产物活性分析 成功构建了原核表达载体pET32a(+)-CpEXP1，将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达获得了CpEXP1重组蛋白。利用MagneHisTM蛋白纯化回收试剂盒获得了纯化的重组蛋白。活性测定表明，CpEXP1重组蛋白具有体外活性，能够促进大豆幼苗下胚轴的伸长。将提取的重组蛋白添加到不同培养阶段的麻点百合培养基中，发现重组蛋白对麻点百合愈伤组织的分化无显著影响，但对增殖以及生根有明显促进作用，并且随着重组蛋白浓度的增加，增殖率以及生根率显著提高，组培苗长势也显著增强。 (2)蜡梅开花阶段划分与脱落力分级 素心蜡梅花蕾着生以1级分枝为主，其中短于20cm的中等枝以及短枝占80.0％，花蕾着生量占82.4％，构成了蜡梅切枝的主要观赏枝组;以花蕾发育过程中花径、雌雄蕊形态以及香味等作为依据，将素心蜡梅的开花过程划分为小蕾期、中蕾期、大蕾期、初开期、盛开期、初萎期和萎蔫期7个阶段;采用单因子实验对蕾径、茎粗以及断面直径与脱落力的关系进行了研究，发现茎粗与花蕾脱落力关系最为密切，相关性R2为0.1216，依次是蕾径和断面直径，相关性R2分别为0.0409、0.0369;以脱落力为依据，将蜡梅中蕾期花蕾分为4组，即Ⅰ:0N＜脱落力＜1.4N，Ⅱ:1.4≤脱落力＜2.8N，Ⅲ:2.8≤脱落力＜4.2N，Ⅳ:脱落力≥4.2N。 (3) CpEXP1基因在蜡梅中的表达及其与扩张蛋白活性、离层形成相关性分析 采用实时荧光定量PCR技术对蜡梅不同组织、不同开花阶段以及不同脱落力花梗中CpEXP1基因的表达进行了分析。结果表明，CpEXP1基因的表达量存在明显的时空特异性。其中在花器官的表达量明显高于营养器官。11个组织中Cp EXP1基因的表达由高到低依次是雄蕊、内花被片、雌蕊、全花、中花被片、外花被片、成熟叶片、根、茎、子叶、幼叶;在花发育不同阶段分析中，萎蔫期花蕾中未提取到RNA，其余6个阶段中CpEXP1基因的表达也存在差异。表达量由高到低依次是:初开期、盛开期、大蕾期、中蕾期、初萎期、小蕾期;在不同脱落力下的花梗分析中，自然脱落花梗中CpEXP1基因的表达量最高，依次是:A(0N＜脱落力＜1.4N)、D（脱落力≥4.2N）、C（2.8≤脱落力＜4.2N）、B（1.4≤脱落力＜2.8N）。通过对不同脱落力下的花梗中扩张蛋白活性的测定，发现扩张蛋白的活性与CpEXP1基因的表达存在正相关。 采用查狄伦测力计以及蛋白体外重组法对瓶插蜡梅花梗脱落力和蛋白活性进行了研究，同时采用石蜡切片法对花梗离层的形成进行了观察。结果表明:1）脱落力与落蕾量呈负相关，与花梗离层发育正相关，脱落力可以作为离层发育阶段的划分依据;2）在脱落过程中，CpEXP1基因的表达及其产物主要在蜡梅花蕾离层发育后期起作用。在瓶插前期，扩张蛋白活性和CpEXP1基因的表达量都稳定在相对较低的水平，脱落力下降和离层的发育也相对缓慢。到了后期，该基因的表达和蛋白活性迅速增强，此时脱落力显著下降，离区细胞严重解体并导致离区断裂。 (4) CpEXP1基因植物表达载体构建及在拟南芥中的表达 根据NCBI登录的核苷酸序列，克隆了蜡梅CpEXP1基因的cDNA编码框全长，并构建了该基因的植物表达载体CpEXP1-2301G。通过花序浸润法转化拟南芥，获得转基因拟南芥T2代。和野生型相比，转基因拟南芥的花序和叶片长度、叶形指数、叶表绒毛密度均较野生型增加，而叶宽变化不明显。转基因植株叶片边缘反卷、畸形，叶片枯萎期、花期以及果实成熟期也均较野生型提前。果柄脱落力测定发现，转基因植株成熟果荚果柄处脱落力较野生型明显降低。表明CpEXP1基因的表达与形态建成、生长发育周期以及脱落密切相关。 (5)蜡梅CpEXP1基因启动子的克隆、生物信息学及表达分析 利用hiTAIL-PCR法分离得到了长度为2521bp的CpEXP1基因启动子区序列CpEXP1-pro。该启动子除具有启动子基本元件外，还含有多种光应答元件、高温及低温胁迫响应元件、水杨酸相应元件以及与种子和胚乳特异表达相关的元件。成功构建了植物表达载体PBI121-CpEXP1-pro，采用农杆菌介导法将其转入烟草进行瞬时表达，检测到该启动子能够驱动GUS基因的表达。将CpEXP1-pro启动子导入拟南芥中。GUS染色发现，在种子萌芽期和开花结实期该启动子活性最强，子叶期以及真叶幼苗期未检测到GUS活性;叶片染色发现该启动子随着叶片成熟衰老表达活性逐渐增强，尤其在老叶叶柄处活性最强;在果荚发育前期，GUS活性最强，随后逐渐降低。当果荚成熟时仅在果柄处检测到活性。表明CpEXP1-pro启动子的启动具有时空特异性，推测该启动子与种子萌发、果实膨大、叶片以及果实脱落密切相关。 CpEXP1基因在蜡梅中的定量分析结果、转化拟南芥的表达以及启动子的功能分析表明，CpEXP1基因的表达具有时空特异性，该基因的表达与种子萌芽、形态建成、生长发育周期以及脱落有密切关系。
NETL
