摘要
背景与目的： 化疗是恶性肿瘤治疗的重要手段之一，长期临床肿瘤化疗所出现的耐药性以及严重的不良反应常常导致化疗失败，因此，寻找可以逆转肿瘤细胞耐药或增加化疗药物敏感性的药物、能够减少化疗药物的严重不良反应或提高机体正常组织耐受高剂量化疗的药物，对改善肿瘤治疗效果具有重要意义。 佛波酯是大戟科植物中广泛存在的四环二萜类化合物，其中活性比较强的成分是12-O-十四烷酰佛波醇-13乙酸酯(12-0-Tetradecanoyl-Phorbol-13-Acetate，TPA)，它是蛋白激酶C的激动剂。TPA具有多种生物学活性，作为潜在的抗白血病药物研究已经完成Ⅰ期临床试验。顺铂、紫杉醇是临床常用的抗肿瘤药物，疗效肯定，但顺铂的肾脏毒性、紫杉醇的骨髓抑制等不良反应成为剂量限制因素，同时也影响患者的生命质量。据文献报道，TPA可以增加肺癌，卵巢癌，宫颈癌，白血病等肿瘤细胞对顺铂的敏感性，增加前列腺癌以及骨肉瘤细胞对紫杉醇的敏感性。临床上肿瘤化疗方案多数是联合用药，其中顺铂和紫杉醇的联合是肺癌、卵巢癌等多种肿瘤的化疗方案，因此本研究拟考查TPA对以顺铂和紫杉醇联用的TP方案是否具有增敏作用以及对TP方案毒性作用的影响，为探讨肿瘤联合化学治疗的新方法提供实验基础。 方法： 1 TPA对TP方案的体外增敏作用 1.1细胞培养 人传代肺癌A549、SPC-A-1细胞均在如下环境条件中培养:温度37℃±0.3℃，相对湿度≥95％，CO2浓度5％±0.1％。所用培养基为含10％胎牛血清的1640。每3天传代1次或视情况传代。 1.2 TPA联合顺铂和紫杉醇对肿瘤细胞增殖的影响 采用MTT比色法检测药物单用及联合应用情况下肿瘤细胞抑制率的变化，绘制量效曲线。并进行统计学分析，评价三药联用对抗肿瘤作用的影响。 2 TPA对TP方案小鼠体内作用的影响 2.1 TPA对TP方案所致动物死亡率的影响 急性毒性实验中，采用大剂量的顺铂和紫杉醇静脉注射给药，观察TPA对两药联用所引起的小鼠的死亡率和存活时间的影响，并进行统计学分析。 2.2 TPA分别对顺铂和紫杉醇的剂量限制性毒性的影响 观察TPA对顺铂的剂量限制性毒性肾毒性以及紫杉醇的骨髓抑制是否具有对抗作用，比较血肌酐、尿素氮、肾组织的病理变化以及外周血细胞，并进行统计学分析。 2.3荷瘤动物体内TPA对TP方案的抑瘤率和毒副作用的影响 运用昆明鼠皮下接种小鼠肝癌细胞H22，接种成功后给予顺铂和紫杉醇以及TPA，观察TPA能否提高TP方案的抑瘤率以及降低其毒性反应。 2.4TPA对TP方案所引起的肾脏氧化应激的影响 采用昆明鼠，观察TPA对肾组织MDA，GSH，SOD的影响，并进行统计学比较，评价TPA的作用。 结果： 1 TPA对TP方案的体外增敏作用 1.1 TPA对细胞增殖的影响 TPA在小于5ng/ml的浓度下对A549和SPC-A-1细胞的增殖均无抑制作用，而在10ng/ml以上对该两种细胞的增殖有明显的抑制现象，并呈浓度依赖性。 1.2 TPA分别对顺铂和紫杉醇的增敏作用 1ng/ml和5ng/ml的TPA与顺铂共同作用72h之后对顺铂的增敏作用并没有差异，因此实验选用1ng/ml TPA与顺铂联合作用72h，A549细胞中顺铂的IC50下降了65.87％（P＜0.05，与顺铂单用组相比），增敏倍数2.92倍。SPC-A-1细胞中，顺铂的IC50下降了59.84％（P＜0.05，与顺铂单用组相比），增敏倍数为2.49倍。但是TPA对紫杉醇没有增敏作用。 1.3 TPA对TP方案的增敏作用 1ng/ml的TPA与不同浓度的顺铂和紫杉醇联合应用，共同作用72h之后，A549细胞中，顺铂的IC50下降了64.58％（P＜0.05，与顺铂联合紫杉醇组相比），增敏倍数为2.82倍，在SPC-A-1细胞中，顺铂的IC50下降了51.29％(P＜0.05，与顺铂联合紫杉醇组相比)，增敏倍数为2.05倍。 2 TPA对TP方案小鼠体内作用的影响 2.1急性毒性实验 急性毒性实验中，一次性注射顺铂和紫杉醇之后，TP组动物死亡率为86.67％，而TPA联合TP组动物的死亡率为26.67％，TPA单用组动物没有出现死亡现象，并且TPA联合TP组的存活时间要明显高于TP组，结果提示TPA可以明显的降低TP方案引起的动物的死亡，延长其存活时间。 2.2 TPA分别对顺铂和紫杉醇的剂量限制性毒性的影响 在顺铂的肾毒性中，TPA可以明显的降低血清肌酐和尿素氮的含量(P＜0.01，具有统计学差异)，HE染色结果显示，TPA联合TP组与TP组相比，肾组织的损伤明显减轻，肾小球充血轻微，并且肾小管扩张较TP组相比明显降低。TPA单用组对动物的肾组织并没有损伤现象，与对照组相比没有明显的差异。而TPA对紫杉醇的剂量限制性毒性，即骨髓抑制没有保护作用，外周血细胞各组之间并没有统计学差异(P＞0.05)。 2.3荷瘤动物体内TPA对TP方案抑瘤率和毒性作用的影响 各组小鼠的瘤重显示，TPA单用组瘤重与对照组动物瘤重相比并没有统计学差异(P＞0.05); TP组与对照组相比差异显著(P＜0.01)，并且TPA联合TP组与TP组相比P＜0.05，差异也具有统计学意义。而各组动物的BUN和CRE， TPA联合TP与TP组相比，差异也具有统计学意义。(P＜0.01)。肾组织的病理变化上来看，TPA联合TP组与TP组相比，肾损伤轻微，肾小球充血不明显，空泡形成较少，球固缩也有明显减轻。 2.4 TPA对TP方案所引起的肾脏氧化应激的影响 通过测定肾组织中MDA，GSH和SOD的含量，结果显示，TP模型组与TPA联合模型组相比，MDA、GSH和SOD含量两组之间具有统计学差异(P＜0.01)，而TPA组与正常对照组相比无统计学差异(P＞0.05)。 结论： 1.TPA体外可以增加肺癌细胞对TP方案的敏感性。 2.TPA体内可以增加TP方案的抗肿瘤活性、降低肾脏毒性。
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