摘要
亨廷顿病（Huntington's disease，HD）是一种常染色体显性遗传的神经退行性疾病，由编码亨廷顿蛋白（huntingtin, Htt）的IT15基因突变所致。 蛋白质的空间结构和代谢稳定性除了受到外界因素的影响以外，也会受到其分子内部肽键构象的变化所影响。其中肽酰-脯氨酰键（由顺式向反式的构象转换由各种肽酰-脯氨酰顺/反异构酶所催化，是影响蛋白的折叠、定位、活性及代谢稳定性的“分子开关”。 肽基脯氨酰顺/反异构酶PIN1（Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting1），能特异性地识别磷酸化的丝氨酸／苏氨酸-脯氨酸（pSer/Thr-Pro，SP/TP）基序，催化其顺/反异构，改变蛋白质的构象，进而影响其活性和稳定性。 本研究的结果表明：PIN1通过分子伴侣和非泛素依赖性蛋白酶体途径，抑制mHtt聚集，促进其蛋白降解，减少mHtt细胞毒性；PIN1与mHtt存在着直接相互作用，该相互作用因为Poly-Q的数量增加而减弱；PIN1与mHtt的相互作用具有序列及氨基酸特异性；Htt氨基端的62E63P是PIN1最有可能的顺/反异构催化位点；PIN1在发病早期先降低，而发病晚期适当恢复的表达水平变化，与HD迟发性、进程性加重病理过程密切相关。 1.过表达PIN1同时减少聚集型和游离型mHtt，并抑制mHtt引起的细胞毒性为了明确PIN1的不同表达水平是否对mHtt的存在状态和细胞毒性产生影响，本研究以N2a为细胞模型，通过转染PIN1过表达质粒和Si-RNA，分别检测mHtt的蛋白水平和细胞毒性变化。同时以R6/2型HD转基因小鼠为模型，在纹状体区进行了过表达PIN1的尝试性治疗，并对治疗后动物的生存时间、体重、行为学变化及聚集物形成情况进行检测。 2. PIN1分别通过分子伴侣和蛋白酶体途径抑制mHtt聚集并促进其降解：已有的研究表明，PIN1除了具有顺/反异构功能之外，并不具有可以直接激活其他代谢途径的能力，因此过表达 PIN1对mHtt的减少作用应该存在着其他代谢途径和蛋白因子的辅助。为了明确这些代谢通路和蛋白因子，我们通过多种抑制剂对可能的代谢通路进行了针对性地抑制，同时通过RNA干扰对多种可能的蛋白因子进行了调控。 3. PIN1与Htt存在直接相互作用，Htt突变情况下该结合作用减弱为了明确PIN1对mHtt的减少和抑制作用是否建立在二者之间的直接相互作用基础上，我们采用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）和mHtt聚集物共定位分析方法，分别检测了PIN1（PIN1全长、突变体及不同长度分解片段）与 Htt（全长、突变体及不同分解片段）之间的相互作用关系。 （1）PIN1与mHtt的结合能力降低。 （2）PIN1通过其中段的52-80区域和C端的HIILRTE序列与Htt结合。 （3）Htt N端的1-17个氨基酸和脯氨酸富集区是Htt-Nt与PIN1的结合区域。 （4）PRRHtt中的62E63P决定Htt-Nt的抗原性质，是PIN1最可能的顺/反异构位点：前文所述，我们怀疑PRRHtt区域中AEEP序列内的EP有可能是PIN1对Htt-Nt的顺/反异构的催化位点。为了证明该位点是否与mHtt的聚集物形成以及降解稳定性相关，我们对该位点进行了相应的点突变。结果发现：Htt62号位谷氨酸（E）突变为丙氨酸（A）后（Htt-E62A，AEAP），Htt-E62A突变体不能再被mHtt抗体（mEM48）所识别；Htt20Q-E62A突变体的蛋白稳定性增加，而难于被降解；Htt160Q-E62A的聚集物形成率显著增加，过表达PIN1不能有效抑制Htt160Q-E62A的聚集物形成；Htt160Q-E62A与PIN1的相互作用显著减弱；而Htt63号位脯氨酸（P）向丙氨酸（A）的突变体Htt-P63A（AEEA），较野生型Htt没有发生显著的性质改变。的这些实验结果说明：PRRHtt中E62是决定Htt N末端抗原性质、空间结构、乃至蛋白稳定性的关键性氨基酸；同时E62也是PIN1与mHtt结合并抑制其聚集物形成、促进游离型mHtt降解作用得以实现的必要氨基酸。 4. mHtt在转录水平和翻译后修饰水平分别对PIN1的表达和功能活性产生抑制为了明确在mHtt的聚集物产生、蛋白积累和毒性发挥过程中，PIN1表达和功能状态是否出现了异常变化，我们对PIN1的蛋白总量、mRNA转录水平、修饰状态以及空间位置分布进行了检测。 （1）mHtt在转录水平抑制PIN1的表达，并通过促进其S16位点的磷酸修饰抑制PIN1的功能：我们首先对R6/2型HD转基因小鼠脑中PIN1的转录水平、蛋白水平和翻译后修饰水平分别进行了检测。结果显示：发病早期PIN1的蛋白水平显著降低，且在总蛋白水平降低的情况下，PIN1的16号丝氨酸（S16）位点的磷酸化（PIN1的功能抑制性修饰）水平却略微升高；同时期PIN1的mRNA表达水平，以及PIN1的转录因子E2F1的蛋白及mRNA水平都显著降低；发病晚期动物脑中PIN1总体蛋白水平仍然降低，但是相对于发病早期不论是从转录水平还是从蛋白水平都出现了相应的恢复；同时期检测E2F1的表达，也出现转录和蛋白水平恢复甚至增加。细胞实验也发现：转染Htt160Q质粒后24 h，PIN1的蛋白水平降低，同时期PIN1 S16位点的磷酸化水平增高，随着转染时间延长PIN1蛋白及磷酸化水平的变化较对照组略微恢复；干扰激酶RSK1、RSK2可显著抑制Htt160Q所引起的PIN1 S16位点磷酸化修饰增高。这些实验结果说明：mHtt从转录水平抑制了PIN1的表达，同时通过 RSK激酶途径促进PIN1 S16位点的磷酸化修饰，抑制PIN1的催化功能。通过Htt20Q、Htt160Q质粒转染大鼠胚胎原代皮质神经元后发现：Htt160Q显著提高了神经元的凋亡率；Htt160Q阳性的神经元内PIN1荧光显著降低；Htt160Q阳性的凋亡神经元内PIN1的蛋白水平急剧降低，其幅度显著高于Htt20Q阳性和转染阴性凋亡神经元中PIN1的蛋白下降率。这说明Htt160Q所促进的神经元凋亡与PIN1蛋白水平的急剧降低直接相关。 （2）转基因动物脑区PIN1与mHtt小颗粒共定位：通过对转基因动物脑片进行PIN1和mHtt的免疫荧光双标后发现：PIN1在神经元中呈散点状分布；两种HD动物模型中PIN1的蛋白水平都显著降低；PIN1阳性小点与1μm以下mHtt小颗粒存在着共定位关系。对这种共定位关系进行统计分析后发现：共定位颗粒占全部mHtt阳性颗粒的比例，要显著低于共定位颗粒占全部PIN1阳性颗粒的比例。这个结果提示我们：mHtt阳性的小颗粒代表着正在形成的聚集核心，PIN1阳性小点则代表着PIN1对底物进行顺/反异构化修饰的活性位点，而PIN1与mHtt的共定位小点有可能就是PIN1对mHtt聚集核心“加工、处理”的一种工作状态。正是因为HD动物脑中PIN1蛋白水平的降低，造成了没有足够的PIN1去定位和处理所有的mHtt聚集核心，因此造成了mHtt聚集物的逐渐增加。我们对同时期TG小鼠和R6/2小鼠脑片中的共定位关系进行横向对比分析后发现：在Poly-Q更多的R6/2型小鼠中，这种共定位关系要普遍低于Poly-Q较少的TG小鼠。这说明Q的数量增多造成了PIN1与mHtt的结合能力减弱，减少了PIN1对mHtt聚集核心的作用能力，从而造成R6/2小鼠较TG小鼠聚集物颗粒更大，发病更早的病理特征。 （3）PIN1主动吸附于mHtt聚集物表面并持续抑制聚集物形成：通过活细胞动态成像技术，我们动态追踪了mHtt-GFP聚集物的形成过程，以及PIN1-Cherry与聚集物的共定位关系。结果显示：过表达 PIN1显著延长了mHtt聚集物的形成时间，且聚集物颗粒小而分散；从 mHtt聚集核心的形成开始PIN1就与之存在着良好的共定位关系。通过变性和非变性抽滤条件检测PIN1与聚集型mHtt的相互作用后发现：PIN1并非被mHtt聚集物颗粒所募集，而是主动结合并吸附在mHtt聚集物表面，持续抑制聚集物的进一步形成和相互融合。 结论本研究证明mHtt的蛋白稳定性、聚集物的形成和积累以及细胞毒性的发挥，与PIN1的表达和功能变化直接相关。PIN1通过促进mHtt与HSP90的结合，利用HSP90的分子伴侣功能纠正mHtt的错误折叠，抑制其聚集物形成。PIN1通过可能存在的顺/反异构作用，改变了mHtt的分子构象，使之更容易被蛋白酶体激活因子PA28γ和PA200的结合，并通过非泛素依赖性的蛋白酶体途径被降解。mHtt在转录水平和翻译后修饰水平对PIN1的表达和功能活性产生了抑制。PIN1的表达和功能被抑制后，细胞失去了对mHtt的有效控制，进而造成mHtt的错误折叠、异常聚集和蛋白累积，最终导致HD的疾病发生。本研究为揭示mHtt异常聚集和HD的发病机制提供了新的实验证据，同时也为寻找更有效HD基因治疗的新靶点提供了重要的科学参考。
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