摘要
目的: 本研究通过检测基因ZNF545(Zinc-finger protein545)在人乳腺癌细胞株、癌组织及正常乳腺组织中的表达水平及启动子甲基化状态，分析ZNF545启动子异常甲基化与其表达的关系，并分析启动子甲基化与乳腺癌临床病理特征的相关性，观察ZNF545对人乳腺癌细胞增殖、周期、凋亡、迁移侵袭等生物学行为的影响，验证ZNF545在人乳腺癌中的生物学功能，深入探讨ZNF545生物学功能调节机制。 方法: 1.逆转录PCR和实时定量PCR分别检测基因ZNF545在人乳腺癌细胞株(BT549, MDA-MB-231, MDA-MB468, MCF-7,T47D,SK-BR-3)中的表达情况和人乳腺癌、癌旁组织中mRNA表达水平。 2.在线分析cancer microdatabase Oncomine数据库，ZNF45在乳腺癌中的表达情况。 3.利用甲基化特异性PCR检测基因ZNF545在人乳腺癌细胞株和人乳腺癌、癌旁及正常乳腺组织中的启动子甲基化状态，并分析ZNF545启动子甲基化状态与乳腺癌临床病理相关性。 4.通过体外细胞实验（克隆形成、CCK-8、划痕愈合实验）检测基因ZNF545对人乳腺癌细胞集落形成、增殖、迁移能力的影响，确定ZNF545在乳腺癌中的生物学功能。 5.通过流式细胞仪、AO/EB双荧光染色法(acridine orange/ethidiumbromide(AO/EB) fluorescence staining)检测ZNF545对乳腺癌细胞周期和凋亡的影响。实时定量PCR检测AP-1和NF-κB信号通路下游信号因子mRNA转录水平。 结果: 1.ZNF545在MCF-7细胞株中的表达缺失，在70％(14/20)的乳腺癌组织中表达下调; 2.数据库结果提示ZNF545在乳腺癌中表达显著下调; 3.在MCF7中ZNF545出现表达缺失和异常甲基化，经去甲基化处理后，ZNF545重新表达。ZNF545在129例乳腺癌组织中甲基化率为29％，在7例正常乳腺组织未见甲基化。ZNF545启动子甲基化与乳腺癌患者临床病理特征无明显相关性; 4.与对照组相比，重新表达ZNF545的实验组，细胞克隆形成能力下降近90％，细胞增殖活性在24 h、48h、72 h明显下降，数据均有统计学意义; 5.重新表达ZNF545的实验组，与对照组相比，G0/G1期细胞比例从47.42％增加至52.36％(p＜0.05)。AO/EB染色显示，实验组凋亡率明显高于对照组(p＜0.05)。Real-time PCR结果表明，重新表达ZNF545的MCF7细胞中c-Jun/AP1、BAX、p53 and Caspase3的mRNA水平明显增高。 结论: 1.ZNF545在乳腺癌细胞中表达缺失，与启动子异常甲基化有直接相关性; 2.ZNF545启动子异常甲基化在乳腺癌中属于特异性表现，但与乳腺癌临床病理特征无明显相关性; 3.ZNF545在乳腺癌中为抑癌基因，有抑制MCF7细胞克隆集落形成能力和降低细胞增殖活性的作用; 4.ZNF545可能通过上调c-Jun/AP1、BAX、p53和Caspase3，引起细胞G0/G1期阻滞及诱导凋亡。
NETL