摘要
背景和目的:肝纤维化是持续性慢性肝脏损伤引起的一种复杂的组织修复反应，缺乏有效的控制将会导致门脉高压、肝硬化，甚至于最终进展为肝细胞癌。全世界肝硬化的负担仍然引人注目，数亿人患有慢性肝脏疾病。越来越多的证据表明慢性肝脏疾病患者经过有效治疗肝纤维化是可以逆转的。尽管如此尚没有有效的抗纤维化药物，因此，肝纤维化的内在机制还有待阐明。静息状态的肝星状细胞激活成为具有肌成纤维细胞样表型和异常细胞外基质(ECM)积累被认为是肝纤维化的发病机制的关键事件。很多研究表明转化生长因子-β1(TGF-β1)在过度的组织重塑过程中发挥了关键作用，能促进成纤维细胞募集、肌成纤维细胞分化、上皮间充质转化和细胞外基质沉积。骨形成蛋白-7（BMP-7）和转化生长因子β同属于TGFβ超家族，研究表明BMP-7能够负性调控TGF-β1活性。然而，BMP-7对肝纤维化的作用及其机制尚未完全阐明。本实验通过观察肝纤维化小鼠模型中表皮生长因子受体(EGFR)的动态表达，以及骨形成蛋白-7干预对其表达的影响，探讨治疗纤维化的新靶点。 方法: 1.肝纤维化小鼠模型的建立及指标检测60只健康雄性ICR小鼠，体重18g-25g，随机分为正常对照组（6只）、模型组（38只）和干预组（16只）。预留30只小鼠用于观察生存率。将四氯化碳溶于甘油中配成40％的四氯化碳溶液，按0.5mL/100 g体重皮下注射，每周两次，注射12周制备肝纤维化模型，模型组小鼠分别在造模后4周、8周、12周随机取10只小鼠处死。干预组小鼠在造模后第8周开始腹腔注射人重组BMP-7（300 pg/g体重），隔天一次，持续4周后处死。正常对照组予常规喂养至12周，观察生存率后全部处死。所有处死小鼠均留取血清及肝组织标本，采用HE和Manson染色观察肝组织病理变化，并进行肝纤维化半定量评分;下腔静脉采血检测ALT、AST和Alb;采用PCR检测各组肝脏TGF-β1和α-SMAmRNA水平，采用Western印迹法检测各组肝脏TGF-β1、α-SMA、EGFR和pEGFR蛋白表达情况。统计学分析应用SPSS19.0对各组数据进行比较分析，P＜0.05提示差异具有统计学意义。 2.HSC-T6细胞的培养及指标检测复苏冻存的肝星状细胞系HSC-T6，培养基为含10％胎牛血清的高糖DMEM，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每24小时换液，待细胞生长至80％-90％融合时按1∶3传代。细胞培养至第三代时接种于六孔板中，接种密度为1.8×105/ml，实验分为对照组、TGF-β15ng/ml组、TGF-β15ng/ml+BMP-7500ng/ml组、TGF-β15ng/ml+BMP-71000ng/ml组、TGF-β15ng/ml+BMP-72000ng/ml组及BMP-72000ng/ml组，共6组，每组设6个复孔。于培养48小时后提取各组RNA及蛋白。采用PCR检测各组细胞TGF-β1、α-SMA和EGFRmRNA水平，采用Western印迹法检测各组细胞TGF-β1、α-SMA、EGFR和pEGFR蛋白表达情况。统计学分析应用SPSS19.0对各组数据进行比较分析，P＜0.05提示差异具有统计学意义。 结果: 1.成功建立小鼠肝纤维化模型:正常对照组、模型组及BMP-7干预组小鼠生存率分别为100％、70％、90％。病理结果显示正常肝小叶结构破坏，大量炎性细胞浸润，门脉区成纤维细胞增生活跃，形成多数典型的假小叶;BMP-7干预组与模型组12周相比，炎性细胞浸润减轻，纤维增生明显减轻，但仍可以见到少量完整假小叶形成。血生化结果显示肝纤维化模型组血清ALT、AST均逐渐升高，在12周达到高峰(ALT191.3±24.5，AST206.6±25.0)，与正常对照组(ALT39.2±4.7，AST41.9±5.3)相比明显升高。Alb逐渐降低，于12周达到最低值(Alb22.2±1.2)，与正常对照组(34.3±3.2)相比明显降低。BMP-7干预组(ALT153.9±18.1，AST177.8±19.2，Alb25.4±0.9)各指标与模型组12周相比均有所缓解（均P＜0.05）。 2.RT-PCR结果:模型组随着纤维化的进展，TGF-β1及α-SMA的mRNA表达量均逐渐增高，于12周时达到高峰（TGF-β1及α-SMA/β-actin吸光度比值分别为1.265598±0.1164554，1.399128±0.0128198），BMP-7干预后（TGF-β1及α-SMA/β-actin吸光度比值分别为0.852859±0.0271796，0.976972±0.0569936)，上述两种mRNA水平均明显降低（均P＜0.05）。 3.Western印迹结果:模型组随着纤维化的进展，TGF-β1、α-SMA、EGFR及pEGFR的蛋白表达量均逐渐增高，于12周时达到高峰（TGF-β1、α-SMA、EGFR及pEGFR/β-actin吸光度比值分别为0.286596±0.0143275，1.321050±0.0067735,1.093709±0.0146172,1.007172±0.0627513),BMP-7干预后（TGF-β1、α-SMA、EGFR及pEGFR/β-actin吸光度比值分别为0.220590±0.0113319,1.110704±0.0017764,0.738560±0.0660173,0.398902±0.0711029)，上述三种蛋白的表达水平均明显降低（均P＜0.05）。直线相关分析显示，TGF-β1与EGFR/pEGFR表达量均呈正相关(rs=0.895、0.859，均P＜0.05)。 4.通过TGF-β1与BMP-7干预肝星状细胞系HSC-T6的研究，于体外水平验证了BMP-7对抗肝纤维化的作用。正常对照组TGF-β1、α-SMA的mRNA与蛋白表达水平均较低，TGF-β1干预后，二者表达量与正常组相比均明显升高(P＜0.05)。而当培养体系中增加BMP-7后，TGF-β1及α-SMA表达量均有所降低，且随着BMP-7浓度的增加，降低趋势更加明显，呈现剂量依赖性(P＜0.05)。同时我们还发现，细胞在加入TGF-β1后EGFR及pEGFR的蛋白表达量较对照组升高，BMP-7干预后可以缓解这一变化。 结论: 1.BMP-7能改善小鼠肝纤维化; 2.在模型组中，随着肝纤维化的发展，EGFR及pEGFR表达水平逐渐升高，提示EGFR的表达及活化可能参与肝纤维化的发生发展; 3.BMP-7干预后肝纤维化明显减轻，TGF-β1、EGFR及pEGFR表达水平随之降低，提示BMP-7改善肝纤维化作用机制可能与调节TGF-β1及EGFR表达有关。
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