摘要
东亚三角涡虫(Dugesiajaponica)是扁形动物门的代表动物，首次出现了两侧对称和中胚层，具有极强的身体可塑性和再生能力，已经成为研究动物进化、胚胎发育及再生的重要模式动物。 胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶广泛存在于动物体中，并行使多种功能，包括食物消化、血淋巴凝结、抗菌活性、黑色素合成以及免疫信号通路激活等，具有典型的His(H)、Asp(D)和Ser(S)催化三联体结构。 从东亚三角涡虫cDNA文库中获得编号为1218-271的cDNA克隆，序列全长706 bp，含有一个609bp的最大开放阅读框(ORF),编码有203个氨基酸组成的蛋白质，推测其分子量约为22.6KDa。序列经NCBI BLASTP程序比对，发现该基因具有完整编码框的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(Trypsin-like serine protease, Tryp_SPc)，将其命名为Djtry，另外其胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域(Tryp_SPc domain)中含有不完全保守的催化三联体结构，其中第一位的His被Lys取代，故推测Djtry为丝氨酸蛋白酶家族同系物。系统进化分析表明， Djtry是一种原始的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。 利用Northern杂交的方法，对Djtry基因是否在东亚三角涡虫中存在和大小进行了鉴定。结果发现阳性信号为单一条带，且大小约为700 bp，与得到的cDNA大小一致。利用整体原位杂交检测整体和再生的涡虫以及涡虫各时期的胚胎发现，整体和再生的涡虫中， Djtry均在肠组织中特异性表达，而在涡虫胚胎发育各阶段， Djtry也伴随着肠的形成而表达，是一种肠的分子标记。 利用Real-time PCR检测经大肠杆菌和食物刺激之后不同时间点Djtry在涡虫体内的表达变化，分析Djtry可能发挥的功能。结果发现经过细菌攻击之后Djtry的表达量上升而食物刺激后表达量相对平稳，因此推断Djtry可能参与涡虫的先天免疫反应，抵御外界细菌的侵入。 为了研究这种突变型的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶是否也具有胰蛋白酶的活性，通过构建原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达，发现Djtry以包涵体的形式大量表达，经过对表达的重组蛋白进行变性、纯化、复性以及Western杂交鉴定，得到成分均一的活性蛋白。利用牛胰蛋白酶为标准品，胰蛋白酶特异性底物BAEE，检测Djtry酶活力与比活力。SDS-PAGE电泳表明诱导表达的融合蛋白为包涵体，分子量约为23kDa，Western杂交结果显示为目的蛋白，对复性纯化的目的蛋白进行酶活检测发现，突变型胰蛋白酶Djtry仍然保持了胰蛋白酶催化性质，但是催化活性相对较弱。
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