摘要
在禽类中广泛流行的H9N2亚型禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)已经引起多例感染人的事件。血清学调查表明，我国部分禽类从业者中H9亚型AIV抗体阳性率可达2.3％～13.7％。人感染H9N2亚型AIV后表现的症状与感染季节性流感病毒相似而容易被人忽视，增加了其在人体内适应突变的机率，更重要的是部分病毒株已经具有结合人样流感病毒受体的能力。本研究中，我们选择1株H9N2亚型AIV分别在哺乳动物模型（小鼠和豚鼠）体内连续适应后评价其适应病毒株的致病力和传播能力，并初步探索影响这些改变的分子机制。 已有研究表明，H5N1亚型AIV和H7N1亚型AIV能够通过在雪貂体内连续传代而获得高效的传播能力。本研究中，我们评价A/Chicken/Shandong/Li-2/2010(H9N2)（简称SD2）病毒株能否通过在豚鼠体内连续传代后获得水平传播能力。适应9代后，病毒株获得了在豚鼠中接触传播能力(2/3)，15代后接触传播能力进一步增加(3/3)。利用反向遗传技术对15代病毒株进行逐一突变后，发现3个氨基酸突变（HA1-Q227P、HA2-D46E和NP-E434K）决定H9N2亚型AIV的接触传播能力(2/3)。HA蛋白的两个突变位点能增加病毒对禽样受体的结合能力。HA2-D46E能够增强病毒的热稳定性;NP-E434K能够显著增强病毒体外的聚合酶活性。除了上述3个关键位点外，我们还发现PB2-D195N对SD2病毒株的传播有一定的协同作用。 SD2病毒株能够通过在豚鼠中适应而获得传播能力，为了比较宿主差异对流感病毒适应突变的影响，我们将SD2病毒株同样在小鼠体内连续传代而得到小鼠适应病毒株。5代后小鼠适应病毒株的致病力比母本病毒株提高1000倍，并且获得3个氨基酸突变(HA-N313D/N496S和PB2-E627K)。HA-N313D/N496S能够增加病毒对人样受体的结合能力，而PB2-E627K能够增强病毒的体外聚合酶活性。进一步，我们评价这株小鼠适应病毒株能否像豚鼠适应病毒株一样在豚鼠中的传播，3只接触组豚鼠的鼻洗液中都没有检测到流感病毒。结果表明SD2病毒株在小鼠体内获得的受体结合能力的增强和聚合酶活性的增加不能使其获得在豚鼠中的传播能力。 聚合酶蛋白影响流感病毒的在宿主中复制及传播能力。上文中我们发现PB2-D195N协同SD2病毒株在豚鼠中的传播。通过Genbank数据库查询，我们发现PB2-195N存在于多个亚型禽流感病毒中，并且与PB2-627K共同存在于少数H5N1流感病毒中。因此，我们将这两个位点同时引入SD2病毒株中并评价其在豚鼠中的传播能力，结果发现这株突变病毒获得了在豚鼠中的接触传播能力(3/3)。不仅如此，这两个氨基酸突变同时扩大了SD2病毒株在小鼠体内的组织嗜性。 我们的研究结果表明，病毒在不同哺乳动物宿主中适应后传播能力与致病能力的变化不同，宿主差异会影响病毒的进化方向。3个氨基酸的适应性突变(HA1-Q227P、HA2-D46E和NP-E434K)就可以使H9N2亚型AIV获得在豚鼠中接触传播的能力(2/3)，而决定病毒致病性的PB2-627K与PB2-195N协同作用后会使病毒获得在豚鼠中的接触传播能力(3/3)。进一步的分子机制分析表明，病毒受体结合特性与聚合酶活性决定病毒的传播能力。本研究丰富对H9N2亚型流感病毒的认知，对大流行流感的预警也具有重要参考价值。
NETL