摘要
葡萄白腐病是由真菌Coniothyrium diplodiella引起，是危害葡萄最严重的四大病害之一。刺葡萄是葡萄科葡萄属东亚种群的一个野生种，其对黑痘病、白腐病、炭疽病等具有很强的抗性已成为葡萄耐湿热、抗病育种的宝贵资源。刺葡萄0943是中国野生刺葡萄的一个单株，单性花雄株。本研究以黑比诺为对照，研究刺葡萄0943抗白腐病相关三个WRKY转录因子的功能。本研究的内容和结论如下: 1.在刺葡萄0943和黑比诺叶片上接种白腐菌并观察菌丝体生长情况，发现刺葡萄0943具有较强抗性。 2.用同源克隆方法分别获得刺葡萄0943的转录因子 VdWRKY49、VdWRKY53和VdWRKY70基因的编码区和启动子区域，分析其序列特征，通过实时荧光定量检测其对白腐病菌和水杨酸诱导的反应，同时以感病的欧亚种黑比诺为对照，分析不同材料中的这些转录因子基因序列及表达差异。结果:来源于中国野生种质刺葡萄0943的VdWRKY49、 VdWRKY53和VdWRKY70基因，在其编码区和启动子区域都有抗病基因的序列特征和位点特征，在DNA和氨基酸水平上与黑比诺中的相应转录因子VvWRKY49、 VvWRKY53和VvWRKY70有差异，这些差异可能造成了其功能的差异;受到葡萄白腐病菌侵染和水杨酸诱导后，刺葡萄0943中的WRKY基因的表达量和趋势与黑比诺不同。生物信息学分析结果表明，VvWRKY49、VvWRKY53和VvWRKY70在葡萄抗病过程中起重要作用，VvWRKY49、VvWRKY53和VvWRKY70基因受到白腐病菌侵染和水杨酸诱导后表达量增加。生物信息学分析和实时荧光定量表明在葡萄抗病途径中VvWRKY49、VvWRKY53和VvWRKY70转录因子具有重要的生物学作用。VdWRKY70经过转基因功能验证表现出对白腐菌具有抗性。 3.通过核定位分析和拟南芥原生质体定位结果表明VdWRKY49不具备核定位功能没有定位到核中，VdWRKY53和VdWRKY70具有核定位信号可以定位到核中。 4.通过农杆菌介导将目的基因转入拟南芥转中，经过筛选验证获得两株含VdWRKY70基因的拟南芥阳性株。叶片离体接菌实验表明，转基因拟南芥表现出对白腐菌的抗性。
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