摘要
抗菌肽不仅具有广谱抗菌作用，对病毒、寄生虫、癌细胞等也有抑制和杀灭作用。乳铁蛋白水解物(LHs)中就有抗菌肽的存在，且乳铁蛋白抗菌肽酸性条件下活性极高，无毒无害，易被人体吸收，在食品添加剂，尤其是饮料的添加剂方面有着广阔的应用前景。本实验的主要内容就是对LHs中的抗菌肽进行分离纯化。 本研究利用胃蛋白酶水解乳铁蛋白，制备水解物。水解条件为乳铁蛋白底物浓度5％，反应温度37℃，反应时间4h，E/S是1000U·g-1，反应pH为2.5。对LHs先后进行盐析、凝胶过滤分离色谱、半制备型高效液相色谱分离等三步纯化，以大肠杆菌（Escherichia coli）为检测菌，抗菌性为指标测定LHs的抑菌活性。具体的研究结果如下: (1)乳铁蛋白被水解后呈长短不一的肽段，本研究选择葡聚糖凝胶Sephadex G-25进行凝胶过滤分离，经实验，确定洗脱液为0.1mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)，洗脱速度0.5mL/min，上样量1mL，上样浓度25mg/mL，紫外检测器波长280nm。经过一步纯化凝胶过滤色谱图有一个拖尾的峰，收集、冷冻干燥、分析抑菌性，产物抑菌率为19.0％。 (2)为改善分离效果，凝胶过滤前采用盐析法将水解物分级。选取不同饱和度硫酸铵((NH4)2SO4)溶液(20％-60％)盐析LHs，盐析产物经Sephadex G-25凝胶过滤，并分析其抑菌活性。实验结果表明，(NH4)2SO4在35％饱和度时析出的LHs的抑菌性最强。经过盐析和凝胶过滤分离两步纯化的产物凝胶色谱图有分明的峰Ⅰ峰Ⅱ两个峰，峰Ⅰ抑菌率更高，为88.0％，峰Ⅰ中含有目标抑菌活性物质。凝胶过滤的同时实现了脱盐。 (3)采用RP-HPLC对二次纯化产物峰Ⅰ进行再次纯化，上样量为100μL，样品浓度40mg/mL，柱温35℃，0.1％的三氟乙酸水溶液作为流动相A液，98％的色谱级乙腈和0.1％三氟乙酸溶液作为流动相B液，洗脱速度3.0mL/min，紫外检测器波长254nm。结果中显示有峰a和几个很小的杂峰，经过收集、冷冻干燥和抑菌性分析，峰a的抑菌性最高，明显高于前两次纯化的产物，抑菌率为92.0％，确定为目标抗菌肽。
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