摘要
目的:观察凝血酶激活的血小板对人外周血CD4+T细胞向Tfh分化的影响。 方法: 1、CD4+T细胞的提取、纯度验证及激活 抽取健康青年男性外周血(n=5)，梯度密度离心法提取外周血单个核细胞(PBMC);将提取的PBMC用免疫磁珠方法分选出CD4+T细胞;流式细胞术鉴定CD4+T细胞分离纯度;CD3/CD28联合抗体激活分选出的CD4+T细胞;流式细胞术检测激活后CD4+T细胞CD69表达。 2、血小板的提取及激活 抽取健康青年男性外周血(n=5)，二次离心法提取血小板;凝血酶(0.2U/ml，37℃，5min)激活提取的血小板;流式细胞术检测激活后血小板CD62P表达。 3、血小板与CD4+T细胞共培养 分别将激活的CD4+T细胞按照如下分组进行培养:A血小板组:激活血小板+CD4+T细胞;B上清组:激活的血小板上清液+CD4+T细胞;C对照组:单纯培养基+CD4+T细胞。 4、观察CD4+T细胞形态变化;共培养72h后收集培养基，ELISA法检测IL-10表达。分别以CD4、PD-1、CXCR5、FoxP3流式抗体标记共培养后的CD4+T细胞，检测各组中Tfh（CD4+PD-1+CXCR5+Foxp3-）占CD4+T细胞比例。 结果: 1、CD4+T细胞磁珠分选纯度鉴定及激活状态检测:流式细胞术验证磁珠分选CD4+T细胞纯度为（95.93±2.14）％。流式细胞术检测CD4+T细胞激活后CD69表达情况，激活组(13.05±2.12)％，明显高于未激活组（1.48±0.25）％，有统计学差异(P＜0.01)。 2、血小板激活状态检测:凝血酶(0.2U/ml，37℃，5min)激活血小板后，血小板表面CD62P阳性表达情况为凝血酶组（46.27±2.58）％明显高于未激活组（10.29±0.44），有统计学差异(P＜0.05)。 3、激活后的血小板同激活后的CD4+T细胞共培养后，镜下观察，与上清组及对照组相比，血小板组CD4+T细胞表现出明显的细胞聚集性。 4、ELISA法检测共培养72h后培养基中IL-10的含量，其中血小板组IL-10含量为（60.77±7.59）pg/ml，明显高于上清组（14.08±2.78）pg/ml及对照组(11.24±2.81) pg/ml，有统计学差异(P＜0.05);而上清组与对照组无统计学差异。 5、流式细胞术检测CD4+T细胞CD4、PD-1、CXCR5、FoxP3表达情况，其中血小板组Tfh占CD4+T细胞比例为（10.75±2.46）％，明显高于上清液组（6.10±3.09）％及对照组（3.00±1.76）％，有统计学差异(P＜0.05)。而上清组与对照组无统计学差异。 结论: 1、激活后的血小板可以促进CD4+T细胞聚集。 2、激活后的血小板可以促进CD4+T细胞IL-10的分泌。 3、激活后的血小板可以促进人外周血CD4+T细胞向Tfh分化。
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