摘要
水霉病（Saprolegniasis）是我国淡水养殖最常见的疾病之一，水霉病会造成全世界范围内水产养殖业的巨大经济损失。水霉病多发生在受损伤的鱼体表面，并可快速传播至健康鱼中。水霉孢子浓度是水霉病暴发的关键因素，因此建立快速、特异、准确的的水霉孢子定量检测方法是及时预警水霉病暴发、减少经济损失的关键。鉴此，本论文对主要淡水养殖区采集的60株疑似水霉病原进行分类鉴定。根据荧光定量 PCR（Real-time PCR）和环介导等温扩增（LAMP）技术原理分别设计引物，建立两种水霉孢子的检测方法并对其进行了评价。利用水霉孢子人工感染草鱼试验，通过荧光定量PCR监测明确水霉孢子浓度与草鱼水霉病暴发的关系。本文主要研究结果： 1、中国主要致病性水霉病原的确定 研究应用ITS区分子系统发育进化分析法和限制性片段长度多态性分析法（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）相结合，对近年来分别采集于中国上海、江苏、江西、四川、河北、浙江、湖北等7个主要淡水养殖区的60株疑似致病性水霉菌（Saprolegnia）进行鉴定分类，并系统分析了我国已报道的致病性水霉菌的分类情况，比较了分别分离自鱼体和卵的多子水霉的生物学特性。研究结果表明，60株疑似水霉菌分为10个基因型，其ITS-PCR-RFLP谱型一致属于典型多子水霉(S.ferax)、寄生水霉(S.parasitica)和澳大利亚水霉(S.australis)分组类型；ITS系统发育进化分析结果显示，我国致病性水霉菌以多子水霉和寄生水霉为主，二者为我国淡水养殖主要的致病性水霉菌病原。此外，对鱼体和卵来源的多子水霉生物学特征进行比对后发现，二者没有明显差异，同一致病菌株既可感染鱼体也可感染卵。 2、荧光定量PCR检测方法和LAMP检测方法的建立 根据水霉菌保守的ITS（Internal Transcribed Spacer, ITS）序列设计特异性荧光定量PCR引物和LAMP方法引物。结果显示两种方法都具有良好的特异性和灵敏度。Real-time PCR与LAMP最低检测限相当，能够检测到1个孢子，比传统PCR检测灵敏度高100倍。 3、水霉孢子浓度与草鱼水霉病诱发的关系 基于人工感染草鱼水霉病模型，利用SYBR Green Real-time PCR检测方法监测养殖水体中水霉孢子浓度与草鱼水霉病发的关系，明确了养殖水体中水霉孢子浓度达到104个/ml时可引起草鱼暴发水霉病，当水霉孢子浓度超过106个/ml时，可以引起草鱼出现死亡。此外，本文将LAMP技术首次用于水霉孢子的定量检测，由于其不需要专用的仪器设备，更适合用于基层水霉病暴发预警。
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