摘要
鹅膏毒肽是一类毒性极大的毒素，其作用机理主要是抑制真核生物RNA聚合酶Ⅱ的活性，作为重要的生化试剂在医学生物学、分子生物学、细胞生物学、发育生物学等学科的研究中有广泛的应用。鹅膏毒肽主要存在于鹅膏属真菌中，另外也存在于盔孢伞属的一些种类中，由于鹅膏菌大多为外生菌根菌，对其进行人工培养很困难，因此，目前鹅膏毒肽主要提取自野生鹅膏菌子实体;因资源有限，造成鹅膏毒肽价格昂贵。盔孢伞作为腐生菌，培养相对容易。本论文首先对盔孢伞菌丝体进行人工培养，进而对其子实体和菌丝体进行鹅膏毒肽的检测。 本文研究的盔孢伞分别采自于湖南浏阳县、湖南绥宁县、湖南保靖县和新疆乌鲁木齐。通过传统的形态比较和现代的ITS序列比对的方法进行菌种的鉴定，确定上述四地采集的标本共有两种;其中，湖南浏阳、绥宁、保靖所采标本为同一种，即条盖盔孢伞[Galerinasulciceps(Berk.) Singer]，而新疆所采标本为纹缘盔孢伞[Galerinamarginata(Batsch) Kuhner];通过筛选，选择采自于浏阳和新疆的标本进行后续实验。 本文采用孢子分离和组织分离法分离出以上两种盔孢伞。在此基础上，进行菌丝体的纯培养，并对菌丝体和子实体进行测序，得到ITS序列，进行比对后发现两者的菌丝体和用于分离的子实体具有完全相同的ITS序列，因此可以认定分离所得菌丝体为对应盔孢伞的菌种。通过培养基的筛选，确定最适基础培养基，再通过单因子筛选，分别对碳源、氮源、pH、温度进行了筛选实验，分别确定两个菌种的最适培养条件。最后，分别提取两种盔孢伞子实体、菌丝体以及液体培养发酵液的毒素，再利用HPLC进行检测，确定鹅膏肽类毒素种类和毒素含量。 通过固体基础培养基筛选，确定HSVA为最适基础培养基;通过单因子筛选，发现两个种的最适氮源均为蛋白胨(1 g/L)+NH4CL(0.1g/L);最适碳源均为葡萄糖，但纹缘盔孢伞G.marginata对糖浓度的需求量略高;最适合菌丝体生长的温度均为20℃;均具有较广的pH值适应范围。通过液体培养基的筛选，发现条盖盔孢伞G.sulciceps的最适碳源为葡萄糖，纹缘盔孢伞G.marginata的最适碳源为红糖;且两个种的最适pH值均为6。通过HPLC，检测出条盖盔孢伞G.sulciceps的子实体毒素含量为1795.3μg/g干重的α-Ama和1925.0μg/g干重的β-Ama，纹缘盔孢伞G.marginata的子实体毒素含量为445.4μg/g干重的α-鹅膏毒素(α-Ama)和527.0μg/g干重的β-鹅膏毒素（β-Ama）;对这两种盔孢伞的菌丝体和发酵液进行了毒素检测，均未测出毒素。 本文最大创新点是在国内首次系统地对两种盔孢伞人工培养的最适条件进行筛选，并对这两种盔孢伞子实体和菌丝体进行毒素检测。
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