摘要
盐胁迫是严重影响植物生长发育的非生物因素之一。土壤盐渍化会引起大多数植物体内Na+过量积累,进而影响植物的生长。盐生植物能在盐渍环境下正常生长,因此,克隆盐生植物的耐盐性关键基因并研究其功能,有助于深入理解植物的耐盐机制,利用相关的基因资源,培育转基因耐盐植物,有效地改善和利用盐渍化土地。 本实验以泌盐盐生植物中华补血草(Limonium sinense Kuntze)为材料,首先研究了补血草幼苗在不同盐浓度下的胁迫响应、SOS1基因的表达变化及中华补血草叶片中抗氧化酶的活性变化;其次,克隆了中华补血草SOS1基因(LsSOS1),构建了过量表达载体、融合基因表达载体及沉默干扰表达载体,在拟南芥中将LsSOS1基因进行了过量表达和 LsSOS1-GFP融合基因的表达并在中华补血草中做了 LsSOS1RNAi遗传转化。对获得的纯合转基因拟南芥及LsSOS1沉默转基因中华补血草进行分子鉴定、耐盐性分析、LsSOS1表达产物定位观察及LsSOS1基因的表达变化研究。进一步了解LsSOS1基因在盐生植物中华补血草耐盐过程中的重要作用。 实验主要结果如下: (1)中华补血草幼苗在不同盐浓度下的胁迫响应及LsSOS1基因的表达变化 弯根实验中,低盐浓度下补血草根的生长情况好于对照,随着盐浓度的升高,根的生长逐渐受到抑制。NaCl浓度高于200mmol/L时,中华补血草受到盐胁迫, LsSOS1基因的表达量升高,根部高于叶片。 (2)盐胁迫下中华补血草叶片中抗氧化酶的活性变化 中华补血草在低盐处理下,酶促活性氧自由基清除系统的各种酶活性与对照相比没有明显变化。但是,随着NaCl浓度的增加,中华补血草受到盐胁迫,活性氧清除酶类(SOD、POD、APX、CAT)的酶活性上升。说明在一定的浓度范围内,补血草可以通过调节自身的抗氧化酶系统及其独特的泌盐、耐盐机制来抵御盐胁迫带来的损伤,维持正常的生长。 (3)中华补血草LsSOS1基因的克隆及序列分析 根据其他物种中保守的SOS1基因序列,设计简并引物,利用RACE的方法克隆得到LsSOS1基因序列,开放阅读框包含3456个核苷酸,推导编码的蛋白质有1152个氨基酸残基组成,与大叶补血草SOS1基因(Limonium gmelinii SOS1)的同源性最高,达到了97%,编码一种Na+/H+逆向转运蛋白。 (4) LsSOS1基因异源过量表达研究 筛选得到了10个过表达LsSOS1的转基因拟南芥株系,选用三个纯合转基因株系进行分子研究和生理生化分析。通过Real-time PCR分析LsSOS1基因在拟南芥中表达量的差异。在不同浓度NaCl胁迫下,转基因植株的萌发和生长情况要优于野生型,转基因植株比野生型植株的耐盐性有所提高,转基因植株的鲜重、干重及K+/Na+比率高于野生型,但是转基因植株间的差异并不明显。 (5) LsSOS1表达产物亚细胞定位分析 筛选得到过量表达P35S::LsSOS1-GFP的转基因拟南芥。在共聚焦显微镜下通过观察GFP的绿色荧光确定LsSOS1表达产物的定位。初步确定了LsSOS1在细胞膜或细胞壁上表达,而不是在液泡膜或细胞质中。为了进一步确认是在细胞质膜上,可以用甘露醇将细胞皱缩质壁分离,再进行观察。 (6) LsSOS1RNAi沉默转基因中华补血草耐逆性分析 通过优化遗传转化体系,外植体的转化率达到了20%,筛选获得了30株 Ls SOS1RNAi沉默转基因株系。 对其中的3个株系进行 LsSOS1基因的表达研究和生理生化指标的测定。通过Real-time PCR分析发现沉默转基因中华补血草SOS1基因的表达量低于野生型。在NaCl处理下,转基因植株的长势不如野生型,耐盐性降低,转基因植株的鲜重、干重及K+/Na+比率低于野生型。
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