摘要
本研究分三部分进行阐述:第一部分为UMSC输注对2型糖尿病及其并发症的临床治疗作用和相关机制研究;第二部分探讨laminin411对UMSC向IPC诱导分化作用及其机制探讨;第三部分为下一步工作计划。具体如下:第一部分脐带间充质干细胞治疗2型糖尿病临床研究 目的: 研究UMSC治疗2型糖尿病及其并发症的安全性、临床疗效及其相关机制，以期寻找一种安全、长效的治疗2型糖尿病及其并发症的方法。 材料与方法: 在获得山东大学第二医院伦理委员会审批同意后，无菌留取健康剖宫产产妇的脐带组织，按照UMSC制备标准操作流程分离、培养、扩增脐带间充质干细胞，通过细胞形态学、免疫表型和多向分化潜能对所获细胞进行鉴定。按照入组和剔除标准选取2009.07-2012.10我院收治的18例T2DM患者静脉输注UMSC，每次间隔2周，共2-3次，按照疗效评价标准，比较治疗前、治疗后第1、3、6月患者的各项指标变化，并详细记录所有不良反应。综合数据使用SPSSI9.0软件分析。 结果: 成功获得符合GMP标准的UMSC，该细胞具有以下特点:呈长梭形纤维样细胞，贴壁生长，可以稳定传代;高表达CD73、CD90、CDI05、CD166，低或不表达HLA-DR、CD34、CD45;具有多向分化的潜能，可以在适宜的条件下，分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。根据疗效评价标准，UMSC治疗分为有效组和无效组，两者在临床基线特征方面无统计学意义(p＞0.05);治疗有效组患者FBG、PBG均显著降低(p＜0.05)，血浆C肽水平和调节性T细胞(Treg)在有效组有升高趋势，但这两个参数的差异未达到统计学意义(p＞0.05)。在治疗过程中，18例患者中只有4例(22.2％)有轻微的发热反应，无其他不良反应。UMSC治疗后随访6个月，所有患者自觉身体一般情况较前改善，幸福指数较前提高。 结论: UMSC治疗2型糖尿病安全可靠，未见严重不良反应。对部分患者，MSC能有效降低空腹和餐后血糖，其作用机制可能与调节Treg生成，抑制异常免疫系统对胰岛β细胞的损伤及改善外周组织对胰岛素的敏感性有关。该研究为进一步应用UMSC有效治疗2型糖尿病奠定了实践基础。 第二部分脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的分化和调控 目的: 观察laminin411对UMSC向IPC分化效率以及IPC胰岛素分泌功能的影响，并探讨其作用机制，为UMSC来源的1PC有效治疗糖尿病奠定基础。 材料与方法: UMSC分离、培养、扩增及鉴定同第一部分。经过4个阶段将UMSC诱导分化为IPC，通过流式细胞术、RT-PCR、Western blot、免疫荧光、DTZ染色及ELISA等检测方法在细胞表面分子表达、mRNA、蛋白水平、是否为胰岛β细胞及胰岛素分泌等方面对所诱导的细胞进行鉴定。在诱导过程中加入laminin411，首先通过上述实验方法体外观察laminin411对UMSC来源的IPC分化和成熟的影响，并研究其作用机制;其次，腹腔注射60mg/kg链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)破坏胰岛β细胞建立Wistar大鼠1型糖尿病动物模型，鼠尾静脉分别输注UMSC、UMSC诱导的IPC(UMSC-IPC)和添加laminin411诱导分化的IPC(laminin411-IPC)，通过临床表现、血糖、C肽、体重、生存分析等指标，观察UMSC、UMSC-IPC和laminin411-IPC对糖尿病大鼠的治疗作用。 结果: 在成功获得符合GMP标准的UMSC的前提下，在胰岛素转铁蛋白(ITS)、尼克酰胺等因子的作用下，经过4个阶段历时2周，成功将UMSC诱导分化为IPC，该细胞具有胰岛β细胞形态，高表达胰岛β细胞的标志物(Pdx1、Insulin)，在高糖刺激下胰岛素分泌量达到（189.8±3.05）μIU/ml。在诱导分化过程中，加入laminin411，IPC的生成量虽无明显增加，但胰岛素分泌量增加3倍以上，达到（612.1±40.78）μIU/ml;在mRNA和蛋白水平上，laminin411可以显著提高IPC Pdx1、Ngn3和insulin mRNA和蛋白的表达;laminin411-IPC组决定性内皮标志物基因Sox17、Foxa2 mRNA表达较UMSC-IPC组明显升高(p＜0.05);相关性分析表明，Pdx1和Foxa2 mRNA的表达量与胰岛素的分泌量成正相关(p＜0.05)。动物实验层面，通过腹腔注射STZ成功构建了1型糖尿病大鼠模型，laminin411-IPC组IPC输注3天后糖尿病大鼠空腹血糖较UMSC-IPC组明显降低(p＜0.05);与UMSC-1PC组比较，laminin411-1PC组能明显降低HbA1c的水平(p＜0.05)，而和UMSC组比较，laminin411-IPC组则能显著降低HbA1c的水平(p＜0.01); Laminin411-1PC组和UMSC-1PC组均能明显提高糖尿病大鼠生存率和增加体重，但两组无明显差异。安全性方面，没有发现明显不良反应。 结论: UMSC在适当条件下能够诱导生成IPC; Laminin411能提高UMSC-IPC的分化程度及增强其分泌胰岛素的功能，其机制是通过DE途径来发挥作用的;动物实验进一步证实，laminin411-IPC能够有效降低糖尿病大鼠的血糖，改善其临床症状、延长生存期;最重要的是，IPC静脉输注是方便、安全可靠的，为将来替代胰腺β细胞大规模临床应用治疗糖尿病奠定了基础。 第三部分:下一步的工作 1.临床研究: 前期工作中，我们按照入组标准选择18例2型糖尿病病人，静脉输注UMSC，6个月随访结果表明UMSC治疗是安全和有效的;对部分患者能够有效降低血糖、减少降糖药或胰岛素的用量，提高生活质量;为进一步评价远期疗效和安全性，我们将对当前病例继续随访观察。目前临床病例较少，可能影响结果的准确性，下一步我们将积极申报国家干细胞临床研究基地，大规模临床试验来进一步验证治疗效果，并探寻UMSC有效治疗糖尿病及其并发症的机制，为UMSC有效治疗糖尿病提供理论依据。 2.基础研究: (1)寻找新型的药物，提高UMSC向IPC的转化效率及增强其胰岛素分泌功能，为体外高效诱导IPC提供新方法，以满足将来大规模临床应用; (2)如何降低IPC的免疫原性，避免植入的IPC遭受免疫系统的排斥，是下一步研究的重点，欲通过以下方式解决: 1)采用UMSC来源的IPC:由于MSC具有低免疫原性，推测其来源的IPC也具有低免疫原性，从而降低机体免疫系统对其的损伤; 2)将UMSC和IPC联合移植，观察能否进一步降低机体免疫系统对IPC的攻击。 3)获得自体的MSC，应用上述方法使其向IPC分化并提高其分化效率和分泌胰岛素的功能，彻底解决免疫排斥问题。 (3)与胰岛移植所面临的问题一致，IPC移植同样需要选择比较理想的移植模式，即细胞的移植部位和方式是决定IPC移植是否成功的重要环节，下一步欲比较不同的IPC移植模式（如静脉、皮下和肌注）对IPC存活及血糖的影响，选择最优的移植模式，有效治疗糖尿病。
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