摘要
籽粒硬度是小麦最重要的品质性状之一，对小麦的磨粉及加工品质有重要的影响。籽粒硬度主要受位于5D短臂上Hardness(Ha)的两个主效基因Puroindoline a(Pina)和Puroindoline b（Pinb）的调控及基因Grain Softness Protein-1（Gsp-1）的影响。本研究首先从一粒小麦（Triticum monococcum）DV92中克隆基因Pinam、Pinbm和Gsp-1m，然后构建单基因过表达载体3个、单基因共转化载体3个、双基因串联共转化载体3个、三基因串联共转化载体1个。本试验通过基因枪介导的方式对普通小麦品种科农199(KN199)幼胚愈伤组织进行遗传转化，经化学除草剂Bialaphos筛选后获得抗性植株;再经PCR检测获得阳性植株。主要研究结果如下: 1.表达载体的构建:以一粒小麦DV92的基因组DNA为模板，克隆出籽粒硬度基因Pinam、Pinbm、Gsp-1m，用PC186构建完成了单基因过表达载体PC186-Pinam、PC186-Pinbm、PC186-Gsm。用pGEM-T Easy构建完成了单基因共转化表达载体pGEM-Pina1m、pGEM-Pinb1m、pGEM-Gsp1m;双基因串联共转化表达载体pGEM-Pina2m-Pinb2m、pGEMPina2m-Gsp2m、pGEM-Pinb3m-Gsp2m及三基因串联共转化表达载体pGEM-Pinb2m-Pina2m-Gsp1m。 2.遗传转化:通过组织培养成功诱导出能用于基因枪轰击的小麦幼胚愈伤5258个，其中用于单基因Pinam、pinbm、Gspm过表达转化的分别有617、610、620个，用于双基因串联Pina2m-Pinb2m、Pina2m-Gsp2m、Pinb3m-Gsp2m共转化的分别有718、535、937个，用于三基因串联Pinb2m-Pina2m-Gsp1m共转化的有1220个。 3.抗性植株筛选:基因枪轰击过的愈伤经过恢复、分化和Bialaphos筛选后，单基因Pinam、Pinbm、Gspm分别获得抗性植株54、67、62棵，双基因Pina2m-Pinb2m、Pina2m-Gsp2m、Pinb3m-Gsp2m分别获得抗性植株79、43、93棵，三基因Pinb2m-Pina2m-Gsp1m获得抗性植株114棵。 4.PCR检测:单基因Pinam、Pinbm、Gspm分别获得3、4、3棵阳性植株，双基因Pina2m-Pinb2m、Pina2m-Gsp2m、Pinb3m-Gsp2m分别获得1、0、2棵阳性植株，三基因Pinb2m-Pina2m-Gsp1m获得4棵阳性植株。 5.单基因T0代植株转录水平检测:RNA反转，通过PCR检测，单基因Pinam、Pinbm、Gspm转基因植株分别各有2棵能扩增出与预期片段大小一致的片段，说明这三个基因已在小麦转基因植株中转录。 本研究对克隆出的Pinam、Pinbm、Gsp-1m基因进行组合，分别构建了单基因、双基因及三基因串联共转化表达载体进行遗传转化，获得了转基因阳性植株。为今后进一步研究Pinam、Pinbm、Gsp-1m基因的相互作用及基因功能奠定了基础。
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