摘要
研究背景： 抑郁症是当今社会最常见的精神类疾病。世界范围内约有3.5亿人患有抑郁症，是导致生活质量降低及造成经济损失的主要原因之一。而目前抑郁症的发病机制仍不甚明确，且大部分病例常规抗抑郁治疗无效。故研究抑郁症的发病机制及有效治疗方法成为迫在眉睫需要解决的问题。 随着生活节奏的加快、生存压力的增加，人们常常处于应激状态中。研究表明慢性应激是造成抑郁症的一项高危因素。但应激是通过怎样的机制影响抑郁症的发病仍尚未明确。大量实验支持长期应激过度激活下丘脑—垂体—肾上腺(HPA)轴，使糖皮质激素分泌增加而引起脑内神经递质调节异常最终导致抑郁症的发生。在动物实验中，心理应激大鼠出现强迫游泳不动时间增加、自发活动运动距离减少等抑郁样行为改变。 海马颗粒细胞对糖皮质激素水平的升高特别敏感，长期暴露于糖皮质激素环境中对神经细胞具有毒性作用。过高水平的皮质酮持续作用引起海马颗粒细胞糖皮质激素受体减少，从而对HPA轴的负反馈抑制作用减弱，激素分泌进一步增加。随着暴露时间进一步延长，糖皮质激素受体将丧失对颗粒细胞的调节功能，同时过度激活谷氨酸能系统，其效应包括过度激活钙依赖酶而引起的自由基神经毒性，进入细胞的葡萄糖载体减少而引起的供能不足，以及为细胞结构和生存提供营养支持的脑神经营养因子合成的减少。在这些机制的共同作用下，长期暴露于应激或高水平的糖皮质激素环境中造成树突萎缩并最终导致颗粒细胞死亡，与结构改变伴随出现依赖于海马的记忆功能的损伤。 海马是中枢神经系统中锌含量最为丰富的脑区之一。近期对情感精神类疾病的研究表明，锌在其病理生理过程中具有重要作用，如调节神经信号传递、氧化应激、影响脑神经营养因子的表达等。生理水平的锌与神经发生、突触形成等神经保护作用有关，而锌稳态失衡将引起神经兴奋性毒性甚至细胞凋亡。所以锌稳态的维持对神经系统正常功能具有重要意义。 临床研究和动物实验均发现，抑郁症患者及抑郁样行为改变的动物血清锌水平较正常对照组降低，而经过有效的抗抑郁治疗后血清锌水平恢复正常。长期缺锌饲喂会导致大鼠抑郁样行为学改变及血清皮质酮水平升高。而慢性应激或给予外源性皮质酮作用一段时间后实验动物也会出现抑郁样行为学改变及血清锌水平下降。表明锌在抑郁症的疾病过程中具有重要作用，并且锌与皮质酮之间存在相互调节，这种相互作用可能在抑郁症的发生发展及转归中具有重要意义。 本研究旨在通过建立慢性束缚应激致抑郁样行为改变的动物模型，探索锌在抑郁症发生发展及治疗中的作用，希望能为抑郁症病因学研究及有效治疗提供一定的实验依据及临床指导意义。 目的： 本实验通过建立抑郁样行为改变的小鼠模型并给与抑郁样行为改变的小鼠丙咪嗪和/或补充锌，以了解其体内锌水平改变情况，希望有助于了解微量元素锌在抑郁症发生发展及治疗过程中的作用，并在此基础上为研究抑郁症的病因及治疗提供实验依据和理论参考。 方法： 一、束缚应激致小鼠抑郁样行为改变模型的建立 雄性ICR小鼠，约20g，随机分为束缚应激组和对照组，每日于18:00～21:00对实验组小鼠进行束缚应激，对照组不做处理。在束缚期间每隔7天监测行为学指标（强迫游泳、悬尾实验、自发活动），直至实验组较对照组出现抑郁样行为改变。 二、小鼠行为学指标的监测 （一）强迫游泳(FST) 测试时将小鼠置于装有温水的圆柱形玻璃容器内5min，记录小鼠在后4min内的不动时间。对每只小鼠进行测量前均需更换容器内的水，以避免之前小鼠所遗留气味对后续实验产生干扰。测试完成后用干毛巾轻柔的将小鼠擦干放回饲养笼中。 （二）悬尾实验(TST) 采用sof-821型行为不动时间测定仪进行测试。用医用胶带将小鼠尾尖固定于测试箱的重力传感器上。根据观察设定好小鼠处于不动状态时的阈值，记录自开始悬挂后6min内不动时间，统计后5min内的不动时间作为最终分析用实验数据。 （三）自发活动(Spontaneous Activities) 将小鼠置于底面积60×60cm2高80cm的暗箱中，箱顶置有摄像装置，记录小鼠放入暗箱内3min的活动情况，采用Ethovision XT软件处理图像，分析小鼠运动的路程。每只小鼠测试完成后清理暗箱，以免遗留的粪便或气味对后续进行测试的小鼠行为产生影响。 三、小鼠血清皮质酮含量的测定 采用神经肽放免药盒（第二军医大学神经生物教研室），遵照说明书操作测定小鼠血清中皮质酮含量。 四、锌含量测定 （一）小鼠血清锌含量的测定 将小鼠麻醉后，眶静脉取血，采集的血液标本立即放于4℃冰箱内静置15min，于4℃离心机中离心3000r×15min，用移液器将上层清亮血清移入1.5ml离心管中备用。取200μl血清用去离子水稀释至1ml，混合均匀后采用原子吸收分光光度计火焰法测定其中锌离子含量。 （二）小鼠海马总锌含量的测定 麻醉方法同上，4℃0.9％生理盐水心脏灌流后，将小鼠头取下置于冰上并迅速将海马取出称量后加入1ml硝酸及高氯酸4∶1混合液高温消化，导出至2ml容量瓶中并用去离子水定容，采用原子吸收分光光度计火焰法测定其中锌含量。 （三）TSQ染色测定海马内游离锌离子含量 麻醉、灌流方法同上，将取下的小鼠头部置于-80℃冰箱中冰冻1小时，将其取出于冰冻切片机中切片(厚度20μm)。贴片后在避光条件下将切片浸没于4.5μM TSQ溶液中孵育1分钟，取出并用0.9％生理盐水冲洗1分钟。在360nm紫外光激发的荧光显微镜下观察。 五、GPR39、CREB、NMDAR、BDNF mRNA表达水平的测定 通过实时定量荧光PCR(RT-PCR)测定小鼠海马内BDNF、CREB、GPR39、NMDA受体(NMDAR)mRNA的表达水平。 六、统计方法 统计分析使用SPSS16.0软件进行，Excel2010进行数据整理及图表绘制，检验水准为α=0.05;统计方法选取两独立样本t-检验和one-way ANVOA(LSD)。 实验结果： 一、束缚应激致小鼠抑郁样行为改变模型的建立 （一）束缚应激对小鼠体重的影响 结果表明，束缚应激3周后实验组较对照组体重降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 （二）束缚应激对小鼠行为学的影响 束缚应激21天后实验组较对照组出现行为学改变，差异具有统计学意义。强迫游泳实验(FFST)不动时间实验组较对照组明显延长(P＜0.001)，悬尾实验(TST)不动时间束缚应激组也明显增加(P＜0.001)，自发活动实验(Spontaneous activity)中束缚应激组小鼠运动路程显著缩短(P＜0.001)。 二、抑郁样行为改变的小鼠血清皮质酮含量 血清皮质酮水平束缚应激组较对照组升高，差异具有统计学意义(P＜0.001)。 三、抑郁样行为改变的小鼠血清锌水平及海马总锌、游离锌水平慢性束缚应激使小鼠出现血清锌水平下降(P＜0.001)及海马总锌含量增加(P＜0.001)。TSQ染色结果显示束缚应激组小鼠海马内游离锌离子增加。 四、抑郁样行为改变的小鼠海马内脑神经营养因子(BDNF)表达水平 慢性束缚应激致抑郁样行为改变的小鼠出现海马内BDNF mRNA表达下降，与正常对照组比较具有统计学差异(P＜0.001)。 五、丙咪嗪及补充锌对抑郁小鼠行为学指标的影响 给予抑郁小鼠有效剂量的20mg/kg/d丙咪嗪或30mg/kg/d的L-天门冬氨酸锌腹腔注射，4周后小鼠行为学指标（悬尾实验、自发活动）恢复正常。虽然低于治疗剂量的5mg/kg/d丙咪嗪或15mg/kg/d L-天门冬氨酸锌补充独立作用时均对小鼠的抑郁行为改变无作用(与对照组比较，悬尾实验P＜0.001，自发活动P＜0.001)，但同时给予5mg/kg/d丙咪嗪和15mg/kg/d L-天门冬氨酸锌可以纠正小鼠的抑郁行为改变。 六、丙咪嗪及补充锌对抑郁小鼠血清锌水平及海马锌含量的影响 腹腔注射20mg/kg/d丙咪嗪或15mg/kg/d或30mg/kg/d L-天门冬氨酸锌4周后均可使抑郁小鼠血清锌水平恢复正常，但5mg/kg/d丙咪嗪无此作用(P＜0.001)。 在海马组织中，给予抑郁小鼠20mg/kg/d丙咪嗪或30mg/kg/d的L-天门冬氨酸锌腹腔注射4周后，小鼠海马总锌含量恢复正常。而5mg/kg/d丙咪嗪或15mg/kg/d的L-天门冬氨酸锌补充独立作用时均对恢复小鼠海马内总锌含量无效，但同时给予5mg/kg/d丙咪嗪和15mg/kg/d L-天门冬氨酸锌可以使小鼠海马内总锌含量恢复正常。海马切片TSQ染色结果显示，给予30mg/kg/d的L-天门冬氨酸锌腹腔注射4周后小鼠海马内游离锌离子水平较正常对照组增加，较束缚应激组降低。 经有效抗抑郁治疗后小鼠体内锌水平恢复正常，表明体内锌稳态的维持与抑郁症治疗之间存在相关性。 七、束缚应激的同时给予丙咪嗪及补充锌对小鼠行为学及锌水平的影响 束缚应激的同时给予小鼠低于治疗剂量的5mg/kg/d丙咪嗪或15mg/kg/d L-天门冬氨酸锌补充，3周后与空白对照组比较，小鼠未出现抑郁样行为学改变。小鼠血清及海马锌水平与对照组比较无统计学差异。 八、GPR39、CREB、NMDAR、BDNF mRNA表达水平的改变 慢性束缚应激致抑郁样行为改变的小鼠出现海马内CREB、GRP39 mRNA表达水平较对照组下降(二者均P＜0.001)，NMDAR mRNA表达水平较对照组升高(P＜0.001)。给予20mg/kg/d丙咪嗪或30mg/kg/d L-天门冬氨酸锌或同时给予5mg/kg/d丙咪嗪和15mg/kg/d L-天门冬氨酸锌4周后可使上述基因表达水平恢复正常。 结论： 本实验通过建立束缚应激致小鼠抑郁行为改变模型，监测出现抑郁行为改变的小鼠血清皮质酮及体内锌水平及脑神经营养因子表达等一系列指标，丙咪嗪治疗及锌补充后对上述指标的纠正作用。结论如下: 1、每天3小时，为期3周的束缚应激可使小鼠出现抑郁样行为学改变，此造模方法可应用于抑郁症相关的动物实验中; 2、在本实验中皮质酮水平升高使体内锌稳态失衡，血清锌水平恢复正常后皮质酮水平也随之恢复正常，表明皮质酮和锌之间存在相互调节关系。二者共同作用于海马组织，对海马细胞功能状态及小鼠行为产生影响。 3、束缚应激致抑郁小鼠血清及海马锌水平失常，而腹腔注射适宜剂量丙咪嗪或/和L-天门冬氨酸锌后恢复正常。本研究中锌水平伴随小鼠抑郁行为的出现及纠正而变化，表明锌在抑郁症的发生发展及治疗过程中具有重要作用。 4、本研究中抑郁小鼠海马内BDNF mRNA表达水平下降，经丙咪嗪治疗或锌补充后恢复正常支持抑郁症的脑神经营养因子假说。 5、本研究中抑郁样行为改变的小鼠海马内GPR39、CREB、BDNF mRNA表达水平下降，而NMDAR mRNA表达水平升高，经丙咪嗪治疗或锌补充后恢复正常。GPR39作为锌敏感膜受体易与锌结合激活环磷酸腺苷反应原件(CRE)通路，最终引起CREB磷酸化，CREB的激活参与神经系统发生和成熟过程，同时CREB作为转录增强子使BDNF的表达量增加。
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