摘要
食物过敏作为食品安全的热点问题在全球引起了广泛关注，甲壳类动物是联合国粮农组织(FAO)公布的八大类过敏食物之一。蟹类等甲壳类水产品味道鲜美、营养丰富，是重要的水产资源;但随着蟹类消费量的增加，因食用蟹类而导致过敏的报道也随之增多。精氨酸激酶（Arginine kinase，AK）是存在于甲壳类和软体类动物的泛过敏原，对其抗原表位的全面了解能够为开发低致敏食品和甲壳类过敏疾病的诊断治疗提供依据。 本文首先从拟穴青蟹（Scylla paramamosain）肌肉中纯化得到AK，通过体外模拟胃液降解AK，降解产物的免疫活性检测结果表明其降解产物仍具有较强的免疫原性;通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）对AK的胃液消化产物进行分离纯化，得到具有IgG/IgE结合活性的5个肽段。分别采用天然AK和分段表达产物rAK1(AA:87-186)、rAK2(AA:172-265)作为抗原建立小鼠过敏模型，以确定AK抗原表位的优势区域，结果显示天然AK组和rAK1组的小鼠血清特异性IgE、Th2型细胞因子IL-4和IL-13均显著升高，表明天然AK和rAK1能够诱导小鼠过敏反应，提示rAK1为AK的抗原表位优势区。 采用纯化AK免疫新西兰大白兔获得兔抗拟穴青蟹AK特异性抗血清，通过ProteinA柱层析得到纯化的兔抗拟穴青蟹AK IgG，以纯化的IgG为靶蛋白对噬菌体展示随机十二肽库进行生物淘选，获得与抗原特异性结合的5个肽段。利用LocaPep软件分析淘选出的肽段，模拟得到4个构象表位C-AK-1(D3A4K43M1A5T49T44I7)、 C-AK-2(L31K33V35T32E11E18F14S34D37)、C-AK-3(V177G172M173D176Q178T174L181K175L187)和C-AK-4(R202L170Y203E190P205W204L187T206Y145)，以及关键氨基酸依次为D3，K33，T174和W204。 根据噬菌体展示淘选结果设计合成了19个重叠肽段，利用甲壳类过敏患者血清检测发现与血清IgG特异识别结合的7个肽段（AA:113-127，127-141，134-148,141-155,204-218，211-225和316-330）和与血清IgE特异识别结合的6个肽段(AA:113-127，127-141，141-155，204-218，211-225和316-330)。进一步通过肥大细胞（RBL-2H3）脱颗粒实验确定AK的4个线性表位:L-AK-1(AA:113-127)，L-AK-2（AA:127-141），L-AK-3(AA:141-155)和L-AK-1(AA:204-218)。 利用十二烷基磺酸钠(SDS)、β-巯基乙醇(β-Me)、二硫苏糖醇(DTT)、尿素和盐酸胍等变性剂处理天然AK，通过免疫印迹检测变性处理后AK的IgE结合活性变化，结果表明AK的致敏性依赖于其空间构象的完整性，存在于分子内部的二硫键Cys201-Cys271对于维持AK的空间构象具有关键作用，是影响AK致敏性的关键位点。 综上，本研究对拟穴青蟹AK的抗原表位进行了定位分析，确定了AK致敏性的关键位点及其构效关系，这些结果为开发低致敏食品和预防治疗过敏性疾病提供理论指导。
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