摘要
[目的] 肝细胞癌(HCC)以手术为主的综合性治疗已取得了明显的疗效，但术后易复发及转移。因此，进一步寻找术后化疗药物具有重要的临床意义。二氢杨梅素(DHM)是一种从葡萄科植物提取黄酮类化合物，具有多种药理活性。研究也发现其具有明显的抗癌作用。本研究使用DHM体外作用于肝癌细胞，检测其对肝细胞的增殖、凋亡和细胞周期的影响，测定p53、Bax、Bak、caspase-3和caspase-9的表达变化，旨在探讨DHM诱导肝癌细胞凋亡的机制。 [方法] 1.运用MTT检测DHM对细胞增殖的作用。 2.用流式细胞术检测DHM对细胞周期的影响。 3.用流式细胞术及TUNEL实验检测DHM对肝癌细胞凋亡的影响。 4.Western bloting检测p53、Bax、Bak、caspase-3、caspase-9的蛋白表达变化。 [结果] 1.DHM对肝癌细胞增殖的影响 1.1用0、5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L的DHM处理肝癌细胞24h，HepG2的抑制率分别为（2.50±1.04）％、（3.71±0.14）％、（5.03±1.12）％、(12.25±1.09)％、(14.90±0.94)％、(19.75±2.01)％; QSG7701的抑制率分别为（4.03±0.12）％、（4.63±0.52）％、（5.03±1.12）％、（5.23±1.12）％、(11.17±1.62)％、(20.08±1.09)％;QGY7701的抑制率分别为（3.83±0.22）％、(5.23±0.42)％、（9.86±1.32)％、(15.23±1.92)％、(17.17±1.62)％、（50.08±1.09)％;Hepal-6的抑制率分别为（3.73±0.52）％、（4.12±0.52）％、(9.83±1.42)％、（8.93±1.52）％、(27.17±1.32)％、(34.98±1.17)％，随着浓度的增加肝癌细胞明显受到抑制(P＜0.01)。 1.2用0、5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L的DHM处理肝癌细胞48h，HepG2的抑制率分别为（2.50±1.04）％、（3.51±0.14）％、(8.03±1.32)％、(18.25±1.39)％、(24.90±0.84)％、(33.75±2.01)％; Huh7的抑制率分别为(18.43±1.42)％、（21.63±0.52）％、（25.03±1.12）％、（31.23±2.15）％、(33.17±1.62)％、(40.08±1.09)％;QGY7701的抑制率分别为（2.53±0.22）％、(2.62±0.42)％、(36.86±1.32)％、(49.23±1.52)％、(56.17±1.62)％、(62.28±1.09)％;QSG7701的抑制率分别为（7.53±0.22）％、（12.86±1.32）％、（15.23±1.52）％、(19.17±1.62)％、(32.28±1.09)％、(52.62±1.42)％; Hepal-6的抑制率分别为（4.73±0.52）％、（5.12±0.52）％、（14.83±1.42）％、（18.93±1.52）％、（29.17±1.32）％、(40.98±1.17)％。上述细胞随着浓度的增加肝癌细胞明显受到抑制(P＜0.001)。MHcc97H的抑制率分别为(5.73±0.52)％、(7.62±0.52)％、(10.83±1.42)％、(9.93±1.52)％、(12.27±1.32)％、(17.98±1.17)％; QGY7703的抑制率分别为(20.73±0.52)％、(22.62±0.52)％、(20.83±1.42)％、(24.93±1.52)％、(23.27±1.32)％、(32.98±1.17)％;SK-HEP-1的抑制率分别为（5.73±0.52）％、（6.62±0.52）％、(11.83±1.42)％、(15.93±1.52)％、(17.27±1.32)％、(19.98±1.17)％。细胞随着浓度的增加肝癌细胞受到抑制(P＜0.05)。 1.3用0、5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L的DHM处理肝癌细胞72h, MHcc97L的抑制率分别为（4.73±0.52）％、(5.62±0.52)％、(12.83±1.42)％、(16.93±1.52)％、(18.27±1.32)％、(25.98±1.17)％;细胞随着浓度的增加肝癌细胞明显受到抑制(P＜0.01)。当DHM为150μm时，抑制率仍＜50％，可认为这些肝癌细胞株对DHM不敏感。 1.4应用0、5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L的DHM作用24、48、72h, HL7702和L-02的抑制率无显著差异（P＞0.05）。 2.DHM对肝癌细胞周期的影响 应用0、50μmol/L、100μmol/L的DHM作用后，HepG2, QGY7701, MHcc97L,Hepal-6和HL7702的G1、 G2/M、S期时间分别无显著差异(P＞0.05)。 3.DHM对肝癌细胞凋亡的影响 3.1 AnnexinⅤ法检测细胞凋亡 应用0、50μmol/L、100μmol/L的DHM处理，24h时HepG2的凋亡率分别为(5.90±1.04)％、(10.90±1.32)％、(17.90±2.07)％; QGY7701的凋亡率分别为(11.03±1.08)％、(15.30±1.08)％、(25.90±2.01)％，不同浓度间比较有显著差异(P＜0.05），48h时MHcc97L的凋亡率分别为(15.93±1.65)％、(14.17±1.07)％、(16.80±0.70)％;Hepal-6的凋亡率分别为(15.17±1.65)％、(47.67±1.72)％、(64.63±4.66)％，不同浓度间比较有显著差异(P＜0.05)。HL7702的凋亡率分别为(12.77±3.07)％、(8.03±1.21)％、(9.17±1.95)％，不同浓度间比较没有明显差异。 3.2 TUNEL法检测细胞凋亡 应用0、50μmol/L、100μmol/L的DHM处理，24h时HepG2的凋亡率分别为(1.24±0.02)％、(12.50±1.02)％、(37.90±2.27)％; QGY7701的凋亡率分别为（0.06±0.01）％、(2.50±0.08)％、(14.90±1.01)％，不同浓度间比较有显著差异(P＜0.05)，48h时MHcc97L的凋亡率分别为(1.20±0.05)％、(0.07±0.01)％、(7.90±0.70)％; Hepal-6的凋亡率分别为（0.05±0.02）％、(22.47±1.52)％、(37.23±2.65)％;HL7702的凋亡率分别为(1.27±1.07)％、(1.33±0.21)％、(1.17±1.05)％，不同浓度间比较有显著差异（P＜0.05）。 3.3正常肝细胞HL7702用≥50μmDHM处理后凋亡率反而下降，肝细胞有增殖现象，说明低浓度的DHM不会引起正常肝细胞的凋亡比较没有显，与对照组比较没有显著差异。 4.DHM对肝癌细胞p53、Bax、Bak、caspase-3、caspase-9蛋白的影响 4.1应用0、50μmol/L、100μmol/L的DHM处理后，HepG2，QGY7701，Hepal-6的p53、Bax、Bak蛋白表达随浓度增加有明显递增趋势，给药组与对照组的灰度值相比较有明显差异(P＜0.01)。MHcc97L的p53、Bax、Bak蛋白表达随浓度增加有递增趋势，给药组与对照组的灰度值相比较有明显差异(P＜0.05）。 4.2应用0、50μmol/L、100μmol/L的DHM处理后，HepG2，QGY7701，Hepal-6、MHcc97L的caspase-3(p19)蛋白表达随浓度增加有递增趋势，给药组与对照组的灰度值相比较有明显差异(P＜0.05)，caspase-9蛋白的表达并没有改变。 4.3应用0、50μmol/L、100μmol/L的DHM处理后，HL7702的p53、Bax、Bak、caspase-3、caspase-9蛋白的表达并没有改变。 [结论] 1.DHM能不同程度的抑制肝癌细胞HepG2、QGY7701、Huh7、QSG7701、MHcc97L、MHcc97H、QGY7703、SK-HEP-1、Hepal-6的增殖，与时间和剂量成正相关。 2.DHM对肝癌细胞HepG2，QGY7701，MHcc97L，Hepal-6和HL7702的细胞周期不产生影响。 3.DHM能诱导肝癌细胞HepG2、QGY7701、Hepal-6、MHcc97L的细胞凋亡，不能诱导HL7702细胞的凋亡。 4.肝癌细胞HepG2、QGY7701、Hepal-6、MHcc97L是通过诱导p53的上调而增加Bax和Bak的表达，抑制Bcl-2的表达，最终激活caspase-3(p19)发生剪切作用，导致细胞凋亡。
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