摘要
背景:桃红四物汤为活血化瘀经典方剂，临床上广泛用于心脑血管疾病的治疗，但其作用的分子机制仍不明确。本研究拟在证实桃红四物汤对脑缺血损伤保护作用的基础上，通过差异蛋白质组学与分子药理学等实验方法阐明其作用的分子机制。本课题获得了重庆市卫生局中医药科技项目(2012-2-87)的支持。 目的:验证桃红四物汤对脑缺血损伤的保护作用，寻找潜在蛋白靶标，表征关键的蛋白信号通路，阐明其作用的关键分子机制。为活血化瘀经典方的作用机制的深入阐释提供参考，并为其用于脑缺血的临床防治提供新的理论依据。 方法: 1、桃红四物汤对脑缺血损伤保护作用的验证。在大鼠暂时性大脑中动脉阻塞(tMCAO)模型上，测定神经功能评分和脑梗塞体积，以考察桃红四物汤对tMACO大鼠脑损伤的保护作用。采用氧糖剥夺-复氧(OGD-Reoxy)体外细胞模型，同时以CCK-8检测细胞存活率，以考察桃红四物汤对PC12细胞氧糖剥夺-复氧损伤的保护作用。 2、蛋白质组学技术鉴定桃红四物汤潜在的靶标蛋白。差异蛋白质组学方法分析桃红四物汤作用的蛋白靶标采用二维凝胶电泳分离桃红四物汤作用前后的PC12细胞蛋白，通过生物质谱鉴定差异表达蛋白;qPCR在mRNA水平验证关键的靶标蛋白对差异蛋白进行分析，选择关键的差异蛋白在mRNA水平进行进一步验证;分析桃红四物汤中各单味药对代表性关键靶标蛋白的诱导作用针对代表性蛋白，采用免疫印迹法检测目标蛋白的表达，以相同浓度(0.5mg·mL-1)单味中药（桃仁、红花、生地、当归、川芎、赤芍）提取物给药处理24小时，分析单味药的诱导活性。采用撤药分析法，即依次从此复方中撤去一味中药以相同浓度(1 mg·mL-1)提取物给药处理24小时。再测定剩余药味组成处方对HO-1的诱导作用，分析方中各药味对整个复方诱导关键蛋白表达影响。 3、关键靶标蛋白通路在桃红四物汤对氧糖剥夺-复氧损伤保护中的作用研究。在PC12细胞上，首先通过免疫蛋白印迹法研究桃红四物汤对关键Ⅱ相蛋白酶HO-1表达的影响;再通过免疫蛋白印迹法与免疫细胞荧光染色法对转录因子Nrf2核转移进行研究，同时还采用免疫蛋白印迹法及相应的抑制剂对Nrf2上游的蛋白激酶的作用进行研究，以表征桃红四物汤对Nrf2信号通路的作用;最后，通过采用PI3K特异性抑制剂抑制PI3K/Akt活性与采用诱骗寡核苷酸技术阻断Nrf2的调控作用，在体外细胞模型上，以确证PI3K/Akt与Nrf2信号通路对桃红四物汤保护作用的影响。 结果: 1、桃红四物汤对脑缺血损伤的保护作用的研究。与假手术组相比，tMCAO损伤模型组动物神经功能评分均值显著降低，显示造模成功。与模型组相比，桃红四物汤提取物0.5 g·kg-1·day-1、1 g·kg-1·day-1、1.5g·kg-1·day-1组动物神经功能评分显著升高。提示桃红四物汤提取物对缺血再灌注引起的大鼠脑损伤具有保护作用。其中桃红四物汤1.0g·kg-1·day-1组效果最优。 与假手术组相比，tMCAO损伤模型组大鼠出现显著脑梗死体积，显示造模成功。与模型组相比，桃红四物汤提取物0.5 g·kg-1·day-1、1 g·kg-1·day-1、1.5g·kg-1·day-1组大鼠脑梗死体积显著降低。提示桃红四物汤提取物可减轻缺血-再灌注引起的脑损伤。其中桃红四物汤中剂量组1.0g·kg-1·day-1组效果最优。提示桃红四物汤可显著减轻tMCAO模型动物脑缺血损伤。 与正常对照组相比，0-2 mg·mL-1桃红四物汤对PC12细胞处理24 h均不具有细胞毒性，提示可用于后续的保护作用研究。与正常对照组相比，OGD-Reoxy模型组细胞活性显著降低，显示损伤造模成功。与模型组相比，桃红四物汤0.5mg·mL-1、1 mg·mL-1、1.5mg·mL-1组细胞存活率均显著升高。提示桃红四物汤提取物对PC12细胞OGD-Reoxy损伤具有保护作用。 2、蛋白质组学技术鉴定桃红四物汤潜在的靶标蛋白。差异蛋白质组学方法分析桃红四物汤作用的蛋白靶标共26个差异表达蛋白点被成功鉴定。Gene Ontology(GO)分析显示这些蛋白参与多种生物过程具有不同分子功能。 Nrf2介导的Ⅱ相抗氧化酶为桃红四物汤的主要靶标蛋白在26个被鉴定的蛋白中有6个属于转录因子Nrf2介导的Ⅱ相蛋白酶。实时定量PCR验证显示0.5mg·mL-1、1 mg·mL-1、1.5mg·mL-1不同浓度桃红四物汤在转录水平可诱导改变这些基因的表达。 桃红四物汤单昧药之间存在对HO-1的协同诱导效应。单味药提取物的试验结果显示，川芎或赤芍对HO-1具有非常强的诱导作用。红花也显著诱导HO-1表达。当归具较弱的HO-1诱导作用，而其它组分没有表现出可检测的诱导HO-1表达作用。 撤药分析法试验结果显示，桃红四物汤全方显著诱导HO-1的表达。撤去川芎或当归后HO-1表达极显著下降。撤去红花或赤芍后HO-1表达也显著降低。桃仁或生地单味药实验对HO-1没有显著诱导作用，而当分别从全方中撤去此两味药后，HO-1表达亦有所降低。四物汤与桃红四物汤比较，表现出较弱的HO-1诱导作用。这些结果表明，桃红四物汤中川芎、当归、红花和赤芍是主要诱导HO-1表达的活性成分。然而，整个复方诱导HO-1表达的能力包含所有单味中药的作用，处方药味间可能存在协同效应。 3、桃红四物汤对脑缺血损伤保护的关键分子机制验证研究。在体外细胞模型上，桃红四物汤能浓度依赖性（0.25 mg·ml-1、0.5 mg·ml-1和1.0mg·ml-1范围内）与时间依赖性地（0-18h内）诱导HO-1表达，并可明显促进Nrf2核转移;0.5 mg·ml-1与1.0 mg·ml-1桃红四物汤均显著地提高了PC12细胞OGD-Reoxy损伤下的存活率。在20μMLY294002预处理下，1.0 mg·ml-1桃红四物汤的保护作用显著降低，0.5 mg·ml-1桃红四物汤的保护作用亦呈现降低趋势，但没有统计学意义。ARE诱骗ODNs能抑制Nrf2调控的Ⅱ相酶表达。在ARE诱骗ODNs预处理下，桃红四物汤(1.0 mg·ml-1)的保护作用显著降低，尽管ARE mut ODNs也一定程度上降低了桃红四物汤的保护作用，但是降低的程度明显小于ARE诱骗ODNs的作用。结果显示，LY294002与ARE诱骗ODNs显著降低了桃红四物汤对OGD-Reoxy损伤PC12细胞的保护，表明桃红四物汤的保护作用可能由PI3K/Akt与Nrf2信号通路产生。 结论: 1.本研究在体内动物模型和体外细胞模型上，验证了桃红四物汤对脑缺血损伤的保护作用; 2.再采用差异蛋白质组学方法系统分离与鉴别定出了26个桃红四物汤作用的潜在靶标蛋白，并发现该方对Nrf2介导的6个Ⅱ相抗氧化酶具有显著诱导作用;并且桃红四物汤单味药之间存在对Nrf2调控蛋白HO-1的协同诱导效应; 3.最后，进一步表征了桃红四物汤对PI3K/Akt和Nrf2信号通路的激活作用，并证实此通路的激活可能是桃红四物汤对脑缺血损伤保护作用的关键分子机制。本研究为桃红四物汤的临床使用提供了分子机制方面的理论依据，具有一定的价值。
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