摘要
肝片吸虫病是十分常见的人畜共患寄生虫病，普遍存在于牛、羊等反刍动物。在我国各省区呈区域性流行，一年四季均可发生，特别是夏秋季节非常普遍。牛、羊的感染率最高，羊的感染率可达30％～50％，甚至部分地区全部感染，牛的感染率有30％～60％，部分地区90％以上。肝片吸虫病会致使动物发育停滞，体重消减，耕牛生产力低下，乳牛产奶量减少，毛和肉产量减少并且品质降低，给畜牧业造成巨大的经济亏损。 硝碘酚腈(Nitroxynil)是20世纪60年代末研制的高效抗肝片吸虫药，对肝片吸虫和大片吸虫的成虫期均都具有很高的疗效，然而药物与血浆蛋白具有高度结合力（结合率＞97％），使游离硝碘酚腈在组织内集聚量很少，以致在推荐剂量下，肝实质中的药物浓度不足以杀灭未成熟的幼虫。在临床中肌内注射与皮下注射为首选方式，然而在给药部位发生炎性肿胀，动物出现摇头、走路摇晃、呼吸急促甚至死亡等现象。 脂质体作为药物的载体系统，将药物包封于脂质双分子层中，可以提高药物在机体内的靶向性，增强治疗效果，降低毒副作用，已经在医学临床中得到广泛的应用。脂质体双分子层生物膜主要由磷脂和胆固醇组成，未经修饰的脂质体经静脉给药进入动物机体中，被巨噬细胞作为“侵入者”吞噬而产生天然靶向性，主要由肝和脾中的吞噬细胞（网状内皮细胞）吞噬，因此脂质体是用于治疗肝寄生虫病、利什曼原虫病等肝脏内寄生虫病的理想药物载体。 本试验使用脂质体包封技术制备硝碘酚腈脂质体，旨在提高其有效生物利用度、延长作用时间、降低药物毒性作用，并探究其临床使用意义。 1硝碘酚腈脂质体的制各 方法:采用薄膜超声法制备硝碘酚腈脂质体，以磷脂-胆固醇质量比(A)、药脂比(B)、超声时间(C)、水化温度(D)四个因素进行正交试验设计L9(34)，以包封率为指标，筛选最佳工艺。 结果:经试验数据分析，各因素对工艺的影响程度:B＞A＞D＞C。最佳工艺处方为:磷脂-胆固醇质量比为2∶1，药脂比为3∶1，超声时间6min，水化温度40℃。经重复性验证该处方包封率为50.05±1.62％。 结论:本试验筛选出的处方及工艺所制各的硝碘酚腈脂质体包封率较好、重现性好。 2硝碘酚腈脂质体的质量评价 2.1 HPLC测定脂质体中硝碘酚腈含量方法的建立 方法:色谱条件:流动相:乙腈-0.01 mol/L磷酸盐pH6.5(25∶75，V/V);色谱柱:Phenomenex-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）;流速:1.5 mL/min;柱温:40℃;检测波长:271 nm;进样量:10μL。 结果:经方法学验证，该色谱条件适合硝碘酚腈含量测定，出峰时间合适，峰形对称，与其他杂质峰分离度良好，重现性与精密度均符合要求。标准曲线为y=25250x-173662，R2=0.9999，线性范围:10～400μg/mL。 2.2粒径的测定 方法:使用Zetasizer Nano分析仪动态光散射法测定脂质体粒径大小。 结果:硝碘酚腈脂质体粒径于200-300nm呈正态分布。 2.3包封率测定 方法:以葡聚糖凝胶柱内径与填充高度比(A)，加样量(B)，流速(C)三个因素设计正交试验，筛选葡聚糖凝胶柱分离硝碘酚腈脂质体的最佳条件，收集脂质体流出液，使用HPLC测定硝碘酚腈含量，计算包封率。 结果:使用100-300μm的葡聚糖凝胶G-50作为层析基质，葡聚糖凝胶柱内径与填充高度比:2∶7，加样量:1.0mL，流速:1mL·min-1。洗脱曲线显示，脂质体洗脱时间为4-15min。收集流出液用10％Trixton-100溶液破乳，用HPLC测定硝碘酚腈含量。 结论:本试验方法制得脂质体粒径分布较均匀，使用葡聚糖凝胶柱分离硝碘酚腈脂质体出峰时间合适，可以有效分离硝碘酚腈脂质体与游离硝碘酚腈。 3硝碘酚腈脂质体在家兔体内药动学试验 方法:选择健康家兔2组，比较耳缘静脉注射相同剂量(8.8mg/kg)的硝碘酚腈注射液与硝碘酚腈脂质体，分别于5min,10min，15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、4h、8h、12h、24h、36h采血，使用上述HPLC方法测定含量，用3P97软件分析药动学模型以及药动学参数。 结果:HPLC绘制血液中硝碘酚腈标准曲线为:y=27547x-31146，R2=0.9995。线性范围均为6.25～400μg/mL。 硝碘酚腈注射液和硝碘酚腈脂质体耳缘静脉注射后的血药浓度-时间分布均符合一级吸收二室模型。 硝碘酚腈注射液在家兔体内主要动力学参数为:A=14.44±1.25μg/mL，α=3.10±0.37/h, B=15.50±2.88μg/mL,β=0.031±0.0028/h,V(c)=0.29±0.00083(mg/kg)/(μg/mL),T1/2α=0.22±0.0028h; T1/2β=22.21±2.48h,AUC=501.18±35.76(μg/mL)*h, CL(s)=0.018±0.0007 mg/kg/h/(μg/mL)。 硝碘酚腈脂质体在家兔体内主要动力学参数:A=8.85±0.71μg/mL，α=1.80±0.25/h，B=13.08±1.22μg/mL,β=0.0155±0.002/h,V(c)=0.4±0.025(mg/kg)/(μg/mL),T1/2α=0.38±0.011h, T1/2β=44.83±0.29h, AUC=851.30±48.37(μg/mL)*h, CL(s)=0.0103±0.0009mg/kg/h/(μg/mL)。硝碘酚腈脂质体消除半衰期延长（T1/2β）、中央室分布容积(Vc)增大，与硝碘酚腈注射液比较有极显著差异(p＜0.01)。 结论:硝碘酚腈脂质体在家兔体内消除半衰期显著延长、中央室分布容积增大，生物利用度升高，揭示其具有缓释作用。 4硝碘酚腈脂质体的肝脏靶向性初步研究 选择健康KM小鼠2组，尾静脉注射相同剂量的硝碘酚腈注射液与硝碘酚腈脂质体，分别于15min、30min、45min、1h、2h、4h、8h、12h、24h解剖小鼠，采集肝脏组织，使用上述HPLC分析方法进行含量测定。 结果 HPLC绘制肝脏组织标准曲线为:y=26156x+36621，R2=0.9996。线性范围为6.25～400μg/mL。硝碘酚腈注射液与硝碘酚腈脂质体肝脏中AUC注=87.00(μg/mL)*h，AUC脂=197.29(μg/mL)*h，肝脏相对摄取率re=2.27。 结论:硝碘酚腈脂质体中肝脏re=2.27，AUC洼与AUC脂差异极显著，表明具有良好的靶向性。 总结:本课题筛选的硝碘酚腈脂质体制备工艺合理，所制备出的脂质体具有较好的药动学特征及肝脏靶向性，揭示其可能有效的改善硝碘酚腈的副作用与生物利用度。
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