摘要
本研究论文由两个相对独立的部分组成:第一部分，斑马鱼消化器官突变体的正向遗传筛选;第二部分，斑马鱼Ube1蛋白的原核表达、纯化及抗体生产。故在此分别阐述:斑马鱼为小型亚热带淡水鱼类。长期以来，斑马鱼因其独特优势，成为研究脊椎动物胚胎发育的完美模型。斑马鱼易于饲养，并在三个月左右达到性成熟。雌鱼每周可产数百粒卵，胚胎透明且在母体外发育，非常适合作大规模遗传筛选。肠道和肝脏都发育自内胚层，然而，我们至今仍不清楚，这两种器官的发育分子机制有怎样的相似性和不同点。针对此问题，我们通过无基因差别的正向遗传筛选，获得肝脏和肠道缺陷的突变体，以探究对这两大器官发育有影响的突变基因。ENU因其高效和无位点偏好性的特点被用于本研究的诱变剂。收集3.5dpf斑马鱼胚胎用于全胚胎原位杂交实验，探针采用肠道特异标记ifabp和肝脏特异标记lfabp，根据表型结果统计和孟德尔遗传定律确定其父母是否为携带隐性突变的杂合突变体。筛选首先在F2代进行，具有一般性缺陷的疑似突变体被我们丢弃。为了排除因高突变背景造成的非遗传性突变表型，我们将F2的疑似突变体杂合子与野生型进行杂交，并在F3代中再次进行筛选。在对78个突变基因组进行筛选后，我们得到了源于22个F2家族的37个F3突变体。对这37个F3突变体进行分型，发现其中31个突变体的肝脏和肠道都有缺陷，4个“肠道特异性突变体”和2个“肝脏特异性突变体”分别表现出肠道或肝脏更加严重的缺陷表型。这些数据表明，斑马鱼中调控肝脏和肠道发育的因子大都是相似或相同的。对突变体的进一步研究，有望让我们对斑马鱼及其它脊椎动物消化器官发育的分子机制有更深的理解。 泛素化修饰是ATP依赖性的过程，需要E1（泛素激活酶）、E2（泛素转移酶）、E3（泛素连接酶）三种酶共同完成。通常，单泛素化修饰改变底物蛋白的亚细胞定位或募集，而K48多泛素化修饰导致目标蛋白的降解，26S蛋白降解复合体识别多泛素化的底物，并将其去折叠、降解成小肽段。泛素化修饰通路对于真核细胞中大多数短周期性蛋白的降解是必需的，而且从酵母到哺乳动物都是保守的。泛素化修饰不仅对细胞的自稳态必不可少，而且对于许多人类疾病具有重大影响。由于泛素依赖性蛋白降解常常被用于调控细胞分裂周期和细胞生长，研究者们发现蛋白降解抑制因子可能被用于癌症和白血病等疾病的治疗。Ube1是泛素化修饰中起主要作用的E1，对于泛素链第一步反应必不可少，对细胞分裂、分化和机体稳态等重要途径具有十分重要的意义。 基于Ube1的结构和生化研究，以及对泛素通路相关酶和蛋白的研究，都离不开高纯度的Ube1蛋白。首先，我们将斑马鱼ube1基因全长CDS序列克隆进pSUMO(pET28a-SUMO)表达载体，并转入E.coli BL21表达菌株，采用亲和层析的方式纯化Ube1蛋白。然而，考马斯亮蓝染色结果显示，纯化得到的蛋白样品中含有较高比例的杂蛋白。Western blot结果显示，其中杂蛋白大都为全长Ube1蛋白断裂的片段，在原核表达之初即存在，从而影响了后续的蛋白纯化。随后，我们改变策略，将Ube1蛋白碳端105个aa的编码核酸序列克隆进pET28a表达载体，并转入E.coli BL21表达菌株，采用亲和层析的方式纯化Ube1 C'terminal短肽，结果得到了纯度较高的蛋白样品。以该蛋白样品为抗原、雄兔为实验动物，生产Ube1抗体。Western blot结果显示，生产的Ube1抗体工作好，且效价高。采用抗原抗体亲和纯化的方法，对上述Ube1抗体进行纯化，使得抗体特异性有了明显提高，且抗体回收率在25％以上。
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