摘要
目的:测定替加环素及多粘菌素E对多重耐药鲍曼不动杆菌(MDR-AB)最低抑菌浓度(MIC)及防耐药突变浓度(MPC);建立高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS-MS)法测定阳离子调节肉汤(CA-MHB)中替加环素、多粘菌素E药物浓度的方法学;建立体外药物代谢动力学/药物效应动力学(PK/PD)模型模拟替加环素、多粘菌素E体内代谢过程中单药及联合用药的抗菌活性;基于MPC理论，分析在体外PK/PD模型中不同用药方案与MDR-AB耐药发生的关系，评价联合用药抑制MDR-AB耐药的能力;初步研究替加环素耐药菌株耐药机制与外排泵介导的关系。 方法:(1)采用微量肉汤二倍稀释法测定替加环素、多粘菌素E对40株MDR-AB的MIC。(2)采用琼脂平板二倍稀释法测定替加环素、多粘菌素E对16株MDR-AB的MPC，计算选择指数(SI=MPC/MIC)。(3)替加环素、多粘菌素E肉汤经固相萃取法预处理后，分别以色谱柱为Phenomenex synergi C18、ZORBAX SB-C18，流动相分别为水（含0.1％甲酸）∶甲醇=90∶10(v/v)、乙腈（含0.1％甲酸）∶水(含0.1％甲酸)=40∶60(v/v)，流速分别为0.4 mL·min-1和1mL·min-1，用电喷雾离子源，正离子方式检测，多重反应监测扫描。(4)建立体外PK/PD模型，模拟替加环素、多粘菌素E目前常用剂量下单药及联合用药在人体内的药代动力学过程对受试菌MDR-AB2、MDR-AB8、MDR-AB36、MDR-AB38杀灭细菌过程中杀菌与恢复生长曲线下面积(AUBC)、菌落形成单位(CFU)统计学差异，并测定菌株MIC的变化，分析PK/PD参数与耐药变化的关系。(5)测定替加环素单药及联合碳酰氰间氯苯腙(CCCP)对体外模型筛选出替加环素耐药突变菌株的MIC。 结果:(1)替加环素对40株MDR-AB菌株的MIC50和MIC90分别为0.25μg/mL和0.5μg/mL，敏感率100％;对40株MDR-AB，多粘菌素E MIC50和MIC90均为0.5μg/mL，敏感率100％。(2)替加环素、多粘菌素E对16株MDR-AB的MIC范围分别为0.125-2μg/mL和0.25-1μg/mL，MPC范围分别为4-32μg/mL和≥64μg/mL，SI分别为8-128和＞64。(3)替加环素线性范围为0.1-5μg·mL-1，定量下限为0.1μg·mL-1，日内精密度≤7.82％，日间精密度≤8.90％;多粘菌素E主要成分为多粘菌素E1、E2，线性范围为0.5-5μg·mL-1，定量下限为0.5μg·mL-1，日内精密度分别为≤2.90％和≤2.86％，日间精密度分别为≤6.65％和≤8.43％。(4)药物体外PK/PD模型中，常规剂量和高剂量替加环素单药模型实测fCmax分别为1.08±0.04μg/mL和2.01±0.20μg/mL，fAUC0-24分别为6.05±0.18μg·h/mL和11.59±0.65μg·h/mL;多粘菌素E单药模型fCmax为3.12±0.25μ g/mL，fAUC0-24为41.18±0.98μg·h/mL。(5)高、常规剂量替加环素联合多粘菌素E在24h log10CFU/mL下降值优于多粘菌素单药组（-2.65±1.73/-2.09±1.47 vs.0.98±0.64，p＜0.01），显示协同作用;高、常规剂量替加环素联合多粘菌素E的AUBC优于多粘菌素E单药方案（106.9±24.5/117.7±23.5vs.168.1±14.2，p＜0.05）;替加环素单药或联合，高、常规剂量组之间在24hlog10CFU/mL或AUBC无统计学差异。(6)替加环素单药方案，其75.2h≥fAUC0-24/MIC≥4.7h或13.92≥fCmax/MIC≥0.87时，4株MDR-AB替加环素MIC较用药前上升4-32倍，多粘菌素E的MIC无变化，联合多粘菌素E能抑制耐替加环素菌株产生;单药多粘菌素E方案中，4株MDR-AB多粘菌素E的MIC较用药前上升＞16倍，替加环素MIC无变化，联合多粘菌素E总的387.2h≥fAUC0-24/MIC≥48.4h或37.92≥fCmax/MIC≥4.74时能抑制耐多粘菌素E菌株产生。(7)加入10ug/mLCCCP后，3株MDR-AB临床分离菌株替加环素MIC无变化，通过体外PK/PD模型筛选出的对应替加环素耐药突变菌株其替加环素MIC值下降4-8倍。 结论:(1)替加环素、多粘菌素E对40株MDR-AB有良好体外抗菌活性，未发现中介、耐药菌株。(2)替加环素、多粘菌素E对16株MDR-AB的MPC高，目前推荐剂量下，单药易落入MSW导致细菌耐药发生。(3) HPLC-MS-MS法专属性好、灵敏、准确，满足本研究药物浓度测定要求。(4)在体外PK/PD模型中，联合方案较单药方案显示出更好杀菌活性，替加环素与多粘菌素E具有协同作用。(5)在体外PK/PD模型中，当药物fCmax＜MPC时，联合用药可以抑制细菌耐药发生，且高剂量组联合优于常规剂量组联合，两药之间无交叉耐药。(6) MDR-AB替加环素耐药突变菌株耐药机制可能与其外排泵介导有关。
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