摘要
蝴蝶兰作为一种名贵花卉，具有极高的观赏价值和商业价值。采用转基因的方法将结构基因或调节基因导入蝴蝶兰是创造蝴蝶兰新品种的有效手段之一。蝴蝶兰中不仅缺乏珍贵的蓝色蝴蝶兰品种，也缺乏具有独特香味的蝴蝶兰品种，因此，花色和花香新品种的培育对蝴蝶兰观赏价值的提高具有重要意义。F3’5’H基因也被称作蓝色基因，其调控蓝色花形成所需色素——飞燕草色素的合成，从而使花色呈现蓝色。月季花香OOMT2基因的表达促进芳香族花香挥发物1,3,5-三甲氧基苯合成途径中关键酶的形成，以此来控制该花香挥发物的合成。本试验选用克隆自三色堇的F3’5’H基因和月季的OOMT2基因构建的植物表达载体，采用农杆菌介导法进行遗传转化研究，以期建立起一套以蝴蝶兰原球茎为受体材料，稳定、高效的蝴蝶兰转基因体系。本试验的主要研究结果如下： 1、蝴蝶兰再生体系的优化：试验以蝴蝶兰的两个商业品种‘红龙’和‘光芒四射’原球茎为受体材料，通过对不同植物生长调节剂组合、不同生长调节剂浓度配比、原球茎切块直径、活性炭含量等影响因素的筛选试验，优化蝴蝶兰转基因受体系统。结果表明：将蝴蝶兰种子接种于3g/L花宝1号+2g/L活性炭+2g/L水解酪蛋白+15g/L蔗糖+2mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+6.5g/L琼脂的培养基上，培养60d左右时挑选体积较大原球茎（直径0.4cm）用于增殖培养；经过切块处理的原球茎为蝴蝶兰遗传转化的直接受体，原球茎切块时应注意切面尽量较少，且切块直径应大于0.3cm，以降低由于切块过度损伤对试验造成的不利影响；原球茎切块的增殖在3g/L花宝1号+3mg/L6-BA+0.6mg/L2,4-D+2g/L活性炭+15g/L蔗糖+6.5g/L琼脂的培养基上进行，完整的原球茎在增殖培养基上持续培养能进一步分化出芽苗，转入3g/L花宝1号+1.5mg/L IBA+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+6.5g/L琼脂的培养基中促进芽苗生根壮苗；蝴蝶兰原球茎对潮霉素的敏感性较卡那霉素更强，潮霉素浓度为8mg/L时即能严重抑制原球茎增殖，而卡那霉素浓度需达到100mg/L时才能对原球茎增殖产生严重抑制，因此，选用浓度为8mg/L的潮霉素对受体材料进行抗性筛选。 2、以‘光芒四射’的原球茎为受体材料进行农杆菌介导转化试验，并对转化体系进行优化研究。试验结果表明：将预培养3天的原球茎切块在OD600=0.4-0.6的重悬液中侵染15min此时的转化效果最好，后于黑暗条件下共培养3 d，以保证外源基因更好的整合进受体细胞。将共培养后的受体材料经过洗脱后，转入含8mg/L潮霉素的筛选培养基中进行四轮筛选培养，这样既可以保证筛选剂的筛选效果还能适当提高材料的生长速度。蝴蝶兰原球茎对头孢霉素（抑菌剂）不敏感，但当头孢霉素浓度达到300mg/L时，对原球茎增殖也产生不利影响，因此，通过综合抑菌剂对农杆菌和原球茎生长的影响，选择300mg/L的头孢霉素进行农杆菌的洗脱，筛选培养基中选择添加50mg/L的头孢霉素进行抑菌。 3、试验以蝴蝶兰品种‘光芒四射’的增殖培养得到的原球茎为受体材料，将其切割为直径>0.3cm的小块后，接入增殖培养基中预培养3 d，后以根癌农杆菌（菌株GV3101、含有植物表达载体pCAMBIA1301-OOMT2、pCAMBIA1303-F3’5’H质粒，以及GUS报告基因、潮霉素抗性筛选基因）重悬液为侵染液进行受体材料的侵染。将受体材料置于OD600=0.4-0.6的重悬液中侵染15min完成材料的转化过程，在无菌滤纸上晾干后接入增殖培养基中，于黑暗条件下完成3 d共培养。此后取出材料，先以含有300mg/L头孢霉素的无菌水进行2-3次洗脱，后接入3g/L花宝1号+3mg/L6-BA+0.6mg/L2,4-D+2g/L活性炭+15g/L蔗糖+8 mg/L Hyg+50 mg/L Cef+6.5g/L琼脂的筛选培养基中，进行四轮筛选培养，每轮15d。将筛选培养出的抗性材料，转入含50mg/L头孢霉素的增殖培养基中至无菌苗分化形成并长至2-3cm，再接入含50mg/L头孢霉素的生根培养基中进行生根培养。通过上述试验方法，共获得40个抗潮霉素的抗性苗，经PCR检测有7个呈阳性（2个为转OOMT2基因，5个为转F3’5’H基因），结合GUS组织染色法的检测结果，可以初步认为目的基因已整合进蝴蝶兰。
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