摘要
前言： 近年来，我国肺癌的发病率与死亡率呈明显上升趋势，且起病隐匿，早期多无症状，约80%患者确诊时已属晚期，肺癌中达80%以上病理类型属于非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC），包括鳞癌、腺癌、支气管肺泡细胞癌、腺鳞癌和大细胞癌等组织学类型，放化疗后5年生存率仍低于20%。目前，表皮生长因子受体（epidermal growth fator receptor,EGFR）是国内外已经公认的一个肿瘤靶向治疗分子，早在2004年Paez和Lynch等发现EGFR突变是对小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）敏感的一个强预测因子，目前发现EGFR中exon19（del E746-A750）和exon21（L858R）约占总突变的90%，又叫经典突变或热点突变，两处热点突变能够增强肿瘤细胞对小分子酪氨酸激酶抑制剂的敏感性。因此，检测EGFR基因的突变状态在NSCLC治疗中具有越来越重要的意义。 目前癌症检测主要依赖于有创性组织病理活检和细胞学检查，但是临床上肺癌患者多数为晚期往往难以取得肿瘤组织标本或不易重复获取，更难于实时监测。因此寻找肿瘤组织替代材料（如唾液、粪便、外周血等）用于基因诊断是当前迫切需要解决的问题，然而，这些样品材料具有干扰成分多、肺癌标志物含量低等特性，且体细胞突变多为杂合突变，标本中突变基因所占比例通常较少。目前，临床上常用突变检测技术如PCR产物直接测序法、Taqman探针法、突变特异性扩增系统(amplificationrefractory mutation system,ARMS)和高分辨率熔解曲线分析法(high resolutionmelting,HRM)等，敏感性都不够高，大大限制了基因变异检测在癌症早期诊断方面的应用。为此，需要探索一种新的更高灵敏度、更高特异性的EGFR基因突变检测方法。 本论文是基于“973”课题（项目编号：2012CB933300）“基于纳米技术的肺癌早期检测研究”和国家自然科学基金课题（项目批准号61271162）“高灵敏检测肺癌外周血中EGFR基因突变的数字PCR芯片”的项目支持。博士课题阶段，我们构建了TaqMan-MGB双探针荧光定量PCR检测体系（TaqMan-MGB Dual-probe Real-time PCR/ TaqMan-MGB Dual Probes Fluorescence Real-time Quantitative PCR）和微流控芯片数字PCR检测体系（Microfluidic Chip Digital PCR）等，为便于以下叙述，分别简记为qPCR和dPCR。鉴于外周血中肿瘤细胞产生的循环DNA量比较少、突变DNA分子更少的特点，通过制作含有纳升级乳滴微反应器的数字PCR芯片，将待测DNA分子分散到上万个纳升级的乳滴中，结合位点特异性扩增及TaqMan荧光探针，通过检测每一乳滴的信号获得EGFR突变情况，利用建立的EGFR基因突变检测方法，研究外周血与组织标本EGFR基因突变的一致性，在此基础上探索一种新的外周血EGFR基因突变的高灵敏、高特异检测方法，用于肺癌的早期检测和诊断，并为肺癌靶向药物的治疗提供依据。 目的： 探索一种新的更高灵敏度、更高特异性的 EGFR基因突变检测方法——数字PCR法，研究外周血与组织标本EGFR基因突变检测的一致性，研究外周血EGFR基因突变情况、基因拷贝数及循环肿瘤DNA(ctDNA)等应用于肺癌早期诊断的可行性及可靠性，为指导NSCLC靶向治疗提供依据。 方法： （1）收集郑州大学第一附属医院2011年10月~2014年6月共116例病例（80例NSCLC、10例SCLC和26例健康者），整理临床资料。 （2）组织和外周血DNA提取、克隆和EGFR外显子19、21引物及探针设计。 （3）构建基于TaqMan-MGB双探针荧光定量PCR技术的EGFR基因突变检测方法（qPCR），并测试灵敏度、敏感度、重复性及线性相关性分析。 （4）构建基于磁力搅拌形成微乳滴技术的数字PCR体系模型：探索一种新的油相配方成分，构建磁力搅拌形成的油包水微乳滴体系，并实现荧光试剂的PCR扩增（乳液PCR），为下一步构建微流控芯片数字PCR检测体系提供技术可行性。 （5）构建基于微流控形成微液滴技术的数字PCR芯片检测体系：首先进行微流控形成微液滴技术的可行性实验，再构建基于液滴技术的微流控芯片数字PCR检测体系模型，最后用水痘带状疱疹病毒荧光检测试剂验证微流控芯片数字PCR检测体系的效能。 （6）构建基于TaqMan-MGB双探针荧光定量PCR技术的微流控芯片数字PCR检测体系（dPCR），并测试灵敏度、敏感度、重复性及线性相关性分析。 （7）DNA测序法、TaqMan-MGB双探针荧光定量PCR法（qPCR）及微流控芯片数字PCR法（dPCR）检测肺癌及健康者EGFR基因突变情况。 （8）分析NSCLC患者EGFR基因突变情况、EGFR基因拷贝数和突变丰度及外周血循环DNA浓度等与临床特征及EGFR-TKIs临床疗效的关系， （9）免疫组化法测定 NSCLC组织中 EGFR蛋白表达情况，分析 EGFR基因突变与蛋白表达的关系。 （10）统计学处理：应用SPSS19.0软件，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)或Kruskal-Wallis检验，两组间比较采用卡方检验或t检验，分析结果适时取Fisher确切概率法（Fisher’s Exact Test）和McNemar Test结果，显著性差异检验采用配对资料卡方检验，变量间关系的相关性分析采用卡方Pearson's R相关性检验判断，一致性检验采用 K检验（ Kappa检验），生存分析采用Kaplan-Meier法，利用Log-rank检验比较组间的PFS差异，各测定值结果以±s表示。双侧检验水准为α=0.05，P<0.05认为差异有统计学意义。 结果： （1）成功构建了 TaqMan-MGB双探针荧光定量 PCR检测体系（qPCR）和一种新颖的微流控芯片数字PCR检测体系（dPCR）。 （2） qPCR法检测灵敏度可达101~102copies/μl，检测突变敏感度可达1%。dPCR法灵敏度在104copies/μl内呈现良好的线性关系，达105copies/μl时阳性乳滴达到饱和，dPCR检测突变敏感性可达到0.01%~0.001%，即在1万个野生分子背景中可检出1个突变分子。dPCR技术能够检测低至0.001%的突变片段，而DNA测序及qPCR法对少于1%的突变是无能为力的，因此dPCR突变检测灵敏度可提高1000倍。 （3）10例SCLC及26例健康者均无EGFR突变，80例NSCLC突变率62.5%（50/80）。dPCR法检测17例NSCLC癌组织EGFR突变率64.7%（11/17）和配对外周血标本中突变率64.7%（11/17）完全一致。dPCR检测80例NSCLC外周血标本EGFR突变率62.5%（50/80），EGFR基因突变与性别、年龄、肺癌家族史、吸烟史、病理类型、分化程度、肿瘤分期及有无转移均无相关性（P>0.05）；dPCR检测EGFR突变率Ⅰ期75.0%（6/8）、Ⅱ期70.0%（14/20）、Ⅲ期58.6%（17/29）、Ⅳ期56.5%（13/23），不同分期间检出率差异无统计学意义（P>0.05）。 （4）EGFR基因总拷贝数、突变拷贝数及突变丰度与患者性别、年龄段、肺癌家族史、吸烟史、肿瘤大小、病理类型、有无远处转移均无关（P>0.05），但突变丰度与肿瘤分期有关，Ⅰ期突变丰度平均值高于Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期（P=0.048），早期（Ⅰ~Ⅱ）突变丰度高于晚期（Ⅲ~Ⅳ）组（P=0.006）。结果还发现，EGFR基因含量（总拷贝数）与ctDNA浓度成线性关系（R2=0.6196，P<0.0001），而突变拷贝数与ctDNA量无线性相关（P>0.05），突变丰度（FAM/HEX）与ctDNA量成负相关（P<0.05）。 （5）80例NSCLC患者分三组：10例突变靶向、40例突变化疗和30例野生化疗，10例EGFR基因突变患者使用TKI治疗后的ORR为50.0%（5/10）和DCR为80.0%（8/10），突变靶向组PFS明显长于野生化疗组和突变化疗组（P=0.000），而野生化疗组与突变化疗组PFS比较差异无统计学意义（P=0.785）。 （6）肺癌组织中 EGFR表达的阳性率64.7%(11/17)高于正常肺组织11.8%(2/17)，差异有统计学意义（P<0.05），EGFR蛋白表达水平与患者性别、年龄、吸烟与否、病理类型、分化程度、TNM分期及是否有远处转移均无相关性（P>0.05），而与原发肿瘤大小有一定关系（P<0.05）。NSCLC患者 EGFR蛋白表达与EGFR基因突变无明确相关性（Pearson's R=0.030，P=0.908>0.05）。 结论： 我们建立的TaqMan-MGB双探针荧光定量PCR法（qPCR）和微流控芯片数字PCR法（dPCR）灵敏度高、特异性强、检测结果准确可靠，尤其dPCR法可用于检测肺癌组织和外周血循环DNA标本中的EGFR基因突变，且结果具有高度的一致性，临床上可以选择肿瘤患者外周静脉血代替癌组织运用dPCR进行基因突变检测，且早期（Ⅰ期+Ⅱ期）突变率不低于晚期（Ⅲ期+Ⅳ期）。肿瘤患者外周血游离DNA量明显增高，尤其当NSCLC发生外周血行转移时，血液中循环肿瘤DNA（ctDNA）量和EGFR基因含量增加，而突变丰度值相对降低。因此，检测外周血EGFR基因突变、循环肿瘤DNA及突变丰度值等，在肿瘤诊断和早期诊断中具有重要价值，对判断肿瘤是否进展能提供重要依据。
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