摘要
食管癌是消化系统中最常见的恶性肿瘤之一并且预后较差，其病死率占恶性肿瘤相关病死率的第6位，且发病率逐年上升。据流行病学统计，我国每年约15万人死于食管癌，占世界病死率的46.6%（WHO，1997），占我国发生率和死亡率的第4位。目前，食管癌的治疗模式主要为手术和放化疗相结合的综合治疗模式，但随访资料显示远期治疗效果均不理想，总体5年生存率低于10%。 近年来，基因靶向治疗成为食管癌研究的重点，而肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL）成为了基因靶向研究的重中之重。TRAIL可以通过识别并结合细胞表面死亡受体DR4和DR5激活下游的凋亡通路，引发进一步的Caspase级联反应，从而诱导细胞发生凋亡。大量资料表明TRAIL能够诱导多种癌症细胞发生凋亡，其中包括食管癌细胞的凋亡。然而，研究中同时发现TRAIL也可以激活正常细胞的凋亡途径，其凋亡诱导作用不具有特异性。 miRNAs是一类非编码的小RNA，它们通过特异性靶向结合mRNA3’非编码区的miRNA反应元件（miRNA response element, MRE）下调基因的表达水平。已有很多miRNA的异常表达被报道参与了肿瘤的发生。其中miR-143在食管癌中低表达，并且可能参与了食管癌的发生。研究表明通过将肿瘤低表达的miRNA的MRE连接到治疗载体上，可以调控治疗基因的特异性表达。目前已有多篇文献报道了基于MRE调控的表达载体，这些载体被应用于多种肿瘤的治疗，包括黑色素瘤、神经胶质瘤、膀胱癌。 我们首先研究了 miR-143和 miR-122在食管癌中的表达情况，结果显示与正常细胞系相比，miR-143和miR-122在食管癌中低表达。接着我们将构建的携带miR-143和miR-122的MRE荧光素酶报告载体psiChek2-143-122转入目的细胞，结果提示在食管癌细胞中荧光素酶表达水平升高，而在正常细胞中则低表达或不表达，说明携带miR-143和miR-122的MRE可以有效的靶向食管癌细胞表达。利用我们构建的腺病毒载体Ad-TRAIL-143-122及其对照物Ad-TRAIL同时感染细胞，应用实时定量PCR及免疫印迹方法检测各组中TRAIL的mRNA和蛋白的表达水平。结果表明Ad-TRAIL-143-122载体可以在食管癌细胞中高表达TRAIL的 mRNA和蛋白，其表达效率与 Ad-TRAIL相近，但在正常细胞中Ad-TRAIL-143-122载体的TRAIL表达水平被显著抑制。 通过使用miRNA的抑制物和相似物分别作用于Ad-TRAIL-143-122处理的食管癌细胞和正常细胞，实时定量PCR法检测各组中miRNA及TRAIL的含量。miR-143、miR-122的混合抑制物转染到正常细胞L-02后，免疫印迹法显示TRAIL的表达有所回升。相反的， miR-143、miR-122的相似物作用于受Ad-TRAIL-143-122感染的食管癌细胞后，TRAIL的表达量呈下降趋势。说明TRAIL的mRNA和蛋白水平确实受到携带miR-143和miR-122的MRE的调控。 为了评估构建基因治疗载体的杀伤能力和对正常细胞的细胞毒性，我们利用Western blot检查各组细胞中caspase-3及裂解的PARP的表达水平；应用MTT法评估各组细胞的活性。免疫印迹法显示感染了Ad-TRAIL-143-122或Ad-TRAIL的食管癌细胞中剪切的caspase-3及裂解的PARP均有较高的表达。相对的，感染了Ad-TRAIL-143-122的正常细胞L-02中的相关凋亡蛋白均不表达。MTT法显示Ad-TRAIL-143-122使食管癌细胞存活能力下降的程度明显高于正常细胞，而不携带MRE调控元件的Ad-TRAIL对两种细胞活性的影响无明显差别。说明构建的Ad-TRAIL-143-122可以有效的杀伤食管癌细胞，而对正常细胞的毒性不明显。 动物体内实验同样验证了我们载体的有效性，用 PBS对照液、Ad-EGFP、Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-143-122分别作用于裸鼠Eca109食管癌体外移植瘤，定期测量肿瘤直径；此外设置无瘤小鼠作为平行对照组，检测各组小鼠静脉血清中谷丙氨酸氨基转移酶的水平，并用免疫组化方法检测各组小鼠肝脏组织中TRAIL蛋白的表达情况。动物实验表明 Ad-TRAIL-143-122能够抑制 Eca109体外移植瘤的生长，其治疗效果和 Ad-TRAIL相近；免疫组化结果显示感染了Ad-TRAIL-143-122和Ad-TRAIL的杂交瘤小鼠组织中均可以检测到TRAIL的表达。这说明我们构建的病毒载体在携带肿瘤的动物中可以有效的表达TRAIL蛋白，起到肿瘤治疗作用。更重要的是对无瘤小鼠的研究表明，注射了Ad-TRAIL的无瘤小鼠血清中谷丙氨酸氨基转移酶水平明显上升，提示Ad-TRAIL具有较强的肝毒性；而PBS对照组、Ad-EGFP组和Ad-TRAIL-143-122组小鼠血清中谷丙氨酸氨基转移酶水平无明显改变；免疫组化法检查Ad-TRAIL-143-122组小鼠肝组织切片中TRAIL的表达受到抑制，而Ad-TRAIL组小鼠肝组织切片中广泛地检测到了TRAIL蛋白的表达。说明与Ad-TRAIL病毒相比，Ad-TRAIL-143-122病毒具有更好的肿瘤特异性，且对正常细胞毒性低。 在该项研究中，我们构建了一个携带杀伤基因且具有肿瘤特异性MRE的病毒载体。通过体内和体外实验，结果显示该基因治疗载体对肿瘤细胞的杀伤具有特异性，更重要的是该载体能够在治疗肿瘤的同时防止肝毒性的发生。因此，该基因治疗策略可能成为一种治疗食管癌的有效方法。
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