摘要
卵巢癌是妇科恶性肿瘤中最常见的类型，在全球范围内，卵巢癌在癌症导致女性死亡的病例中占第15位。每年超过二十多万的新增病例，其病程发展迅速，死亡率高。由于卵巢癌早期缺乏典型的临床症状、缺乏肿瘤标志物等有效的筛查手段等原因，约有70%的卵巢癌诊断时已是晚期。卵巢癌的治疗多数依赖手术基础上的化学治疗，但随着化疗疗程的增加，多数患者最终出现多药耐药(multidrug resistance, MDR)，是卵巢癌治疗的难点之一。因此寻找有效的逆转卵巢癌耐药的药物是目前研究的热点之一。 姜黄素(Curcumin, CCM)是从姜科植物的根茎所提取，其有效成分为一种植物多酚，具有多种生物学功能。姜黄素具有广谱的抗肿瘤活性，是潜在的天然抗癌药物。姜黄素可以通过介导癌细胞的不同信号通路从而达到抑制肿瘤的作用。随着研究的深入，发现姜黄素同时也具有逆转MDR的作用，主要机制为逆转相关蛋白及逆转凋亡基因，但其逆转紫杉醇（paclitaxel，PTX）耐药、对 PTX的增效作用及其机理目前尚不明确。 目的： 本研究以卵巢癌细胞株SKOV3及SKOV3/Taxol-25为研究对象开展，探讨姜黄素对该细胞增殖性的影响，同时研究姜黄素对紫杉醇耐药的增敏作用。通过流式细胞检测姜黄素对SKOV3及SKOV3/Taxol-25细胞凋亡的影响，并通过检测miRNA-9、P-gp及p38MAPK的表达水平，进一步探讨姜黄素抗卵巢癌的作用及寻找逆转卵巢癌耐药的相关信号通路，为中药化疗剂及其增敏剂的临床应用提供理论依据。 方法： 1） MTT进行细胞存活率检测，设立1个对照组，7个实验组，使用浓度为10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM的姜黄素分别处理细胞，探讨姜黄素对卵巢癌细胞株SKOV3及SKOV3/Taxol-25存活率的影响。 2） MTT法检测姜黄素对卵巢癌细胞株 SKOV3及其紫杉醇耐药株 SKOV3/Taxol-25细胞的增敏作用，共设立10个不同浓度的紫杉醇分别与姜黄素共同处理细胞，观察姜黄素对耐药卵巢癌细胞的增敏作用。 3）采用流式细胞仪分析，对姜黄素单独及与紫杉醇(PTX)联合处理细胞后，对细胞凋亡的影响，探讨姜黄素抗肿瘤及增敏作用可能的途径。 4）采用Real-time PCR法检测P-gp、p38MAPK及miRNA-9的表达量变化，研究姜黄素单独及与紫杉醇(PTX)联合作用对卵巢癌细胞 SKOV3/Taxol-25中 P-gp、p38MAPK基因表达及miRNA-9水平的变化。 5）运用 Western-blot方法，检测姜黄素单独及联合紫杉醇(PTX)处理的SKOV3/Taxol-25细胞中P-gp、p38MAPK蛋白表达量的变化。 结果： 1、不同浓度姜黄素作用人卵巢癌细胞SKOV3及其紫杉醇耐药株SKOV3/Taxol-25不同时间，结果显示姜黄素可以抑制这两株细胞的生长，其抑制作用随药物浓度和作用时间的增加而增强，其IC50分别是SKOV324h为42.62uM；SKOV3/Taxol-2524h为41.69uM；SKOV348h为37.36uM；SKOV3/Taxol-2548h为37.59uM。 2、不同浓度紫杉醇单独或者联合低毒剂量的姜黄素(50 uM)作用这两株细胞系，其IC50分别为：SKOV3+PTX为5.584ng/ml；SKOV3+PTX+CCM为1.28ng/ml；SKOV3/Taxol+PTX为46.78ng/ml；SKOV3/Taxol+PTX+CCM为8.794ng/ml。结果表明，当紫杉醇与姜黄素联合使用时，无论是敏感株还是耐药株的IC50较紫杉醇单独使用时明显下降，说明姜黄素能增强PTX对卵巢癌细胞的敏感性。 3、通过流式细胞仪对细胞凋亡的检测结果表明，与对照组比较，姜黄素单独使用或姜黄素与紫杉醇联合使用均能诱导增加SKOV3/Taxol-25的细胞凋亡，且两者联合使用时诱导效果更加明显，表明姜黄素可以诱导细胞凋亡，与PTX有协同作用 4、10 ng/ml PTX、50 ng/ml CCM单独及联合用药作用SKOV3/Taxol-25细胞48h后，经荧光定量PCR检测，结果表明，姜黄素可以使 SKOV3/Taxol-25细胞中的P-gp表达下调，而p38MAPK及miRNA-9的表达均上调。 5、10ng/ml PTX、50ng/ml CCM单独及联合用药作用SKOV3/Taxol-25细胞48h后，P-gp及p38MAPK蛋白的表达情况的Western-blot结果显示，CCM单独及与PTX联合用药可明显降低P-gp在蛋白水平的表达，而同时增加p38MAPK在蛋白水平的表达。 结论： 1、姜黄素对卵巢癌细胞SKOV3及SKOV3/Taxol-25具有明显的抑制作用，其抑制作用具有剂量和时间依赖性。 2、姜黄素对卵巢癌细胞SKOV3及紫杉醇耐药的卵巢癌细胞SKOV3/Taxol-25均具有不同程度的增敏作用，对耐药株的增敏作用尤其明显。 3、姜黄素具有诱导卵巢癌细胞SKOV3及SKOV3/Taxol-25凋亡的作用，且这种作用在与紫杉醇联合使用时效果更好。 4、姜黄素单独或者联合紫杉醇共同使用时，可以从基因表达水平和最终的蛋白表达水平上下调P-gp和上调p38MAPK，可见姜黄素的抗肿瘤及其逆转耐药的作用可能是通过调节耐药相关基因实现的；另外，姜黄素还通过miRNA参与到逆转肿瘤的耐药作用中。
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