摘要
目的： 观察2型糖尿病（T2DM）大鼠成模过程中血浆内毒素水平与胰岛素抵抗的关系；观察盐酸小檗碱干预T2DM大鼠的疗效，及其对宿主肠道菌群结构和血浆内毒素水平的影响，探讨盐酸小檗碱治疗T2DM大鼠的作用机制。 方法： 选择健康的雄性SD大鼠66只，出生年龄均为6-8周，体重180g-200g，随机分为两组:正常对照组（简称 NC组， n=24）和 T2DM组（简称 T2DM组， n=42）。NC组大鼠普通饲料喂养。T2DM组大鼠经高糖高脂膳食喂养12周后，隔夜禁食8小时后于腹腔内注射链脲佐菌素（STZ），剂量为30mg/kg，每隔2日于鼠尾处取血测大鼠的空腹血糖（FBG），FBG>7.8mmol/L则认为造模成功，如连续2次以上FBG<7.8mmol/L则认为造模失败。高糖高脂饲料配方：基础饲料65%、猪油10%、蔗糖15%、干蛋黄10%。 于T2DM大鼠成模过程中，即高糖高脂饲料喂养第4、8周时，以及成模后，分别随机选取NC组和T2DM组各6只大鼠，禁食8小时后给予20%乌拉坦0.4 ml/100g麻醉大鼠后，测定大鼠体重，并经腹主动脉采血，无菌条件下分离血浆2ml分装于无菌EP管内，同时分离血清，上述标本均于-80℃冻存，留取部分肝脏右叶组织，置于包埋盒内迅速投入10%中性福尔马林液24小时后制备腊块。 T2DM组成功获得T2DM大鼠20只，取其中体重相近的18只大鼠随机分为持续高糖高脂对照组（简称HSHF组，n=6，继续高糖高脂饲料喂养)、单纯饮食干预组（简称干预I组， n=6，改为普通饲料喂养）、盐酸小檗碱干预组（简称干预II组，n=6，改为普通饲料喂养的基础上给予盐酸小檗碱200mg/kg/d灌胃)。干预8周后，与正常对照组大鼠一起同上处理，测定大鼠体重，留取血浆、血清冻存于-80℃冰箱，制备肝脏右叶组织腊块。同时留取少量结肠内粪便，取2ml置于Rnase EP管内液氮冷冻30分钟后移置-80℃冰箱保存。 上述血标本同批测定以下指标，鲎试剂显色基质法测血浆内毒素（LPS），免疫浊度法测血清C反应蛋白（CRP）、谷丙转氨酶（ALT）、血甘油三酯（TG）、空腹血糖(FBG)，放免法测空腹胰岛素（FINS），计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），计算公式：FPG(mmol/L)×FINs(mIU/L)/22.5。RT-PCR测定粪便中双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌的含量。肝脏蜡块行HE染色，观察肝组织病理学变化。 结果： 1.高糖高脂饮食联合STZ诱发大鼠T2DM形成过程中胰岛素抵抗程度与血内毒素水平之间的关系： 1.1.第4周末，与NC组相比，T2DM组大鼠体重增加，ALT、TG、CRP、LPS水平升高，FPG、FINS及HOMA-IR无明显变化，差异有统计学意义（P<0.05）；T2DM组大鼠的肝脏病理切片可见以小泡性脂滴为主的肝细胞脂肪变性，气球样变。 1.2.第8周末，与NC组相比，T2DM组大鼠体重增加，ALT、TG、CRP、LPS水平均升高， FPG、FINS及 HOMA-IR水平轻度增高，差异有统计学意义（P<0.05）；T2DM组大鼠肝脏病理切片观察见以大泡性脂滴为主的肝细胞脂肪变性，气球样变。 1.3.第14周末，与NC组相比，T2DM组大鼠毛色无光泽，活动少，体重增加较为显著，ALT、TG、CRP、LPS水平显著升高，FPG、FINS显著升高，HOMA-IR增大，差异有统计学意义(P<0.05)；T2DM组大鼠肝脏组织病理切片观察见肝细胞呈弥漫性空泡样脂肪变性，肝细胞脂肪变性，气球样变，炎性细胞浸润，炎症程度加重。 1.4.血LPS水平与IR程度之间呈正相关，r=0.740，P<0.01。 2.盐酸小檗碱、单纯饮食治疗T2DM可能的作用机制： 2.1.盐酸小檗碱、单纯饮食治疗T2DM大鼠的疗效：与正常对照组（NC组）相比，干预 I组、干预 II组大鼠体重、FPG、FINS、ALT、TG均高于 NC组（P<0.05）；肝脏病理切片可见：肝细胞脂肪变性程度明显于NC组。与持续高糖高脂对照组（ HSHF组）比较，干预I组、干预 II组大鼠体重、FPG、FINS、ALT、TG均低于HSHF组（P<0.05）；肝组织病理切片示：肝细胞脂肪变性，气球样变，少量炎性细胞浸润病变较HSHF组减轻。与干预I组相比，干预II组HOMA-IR、CRP、LPS减少显著（P<0.05）；肝细胞脂肪变性程度明显改善于干预I组，炎症浸润显著减少。 2.2.盐酸小檗碱、单纯饮食治疗T2DM大鼠后内毒素水平的变化：与NC组相比，干预I组、干预II组大鼠HOMA-IR、CRP、LPS均高于NC组（P<0.05）；与HSHF组比较，干预I组、干预II组大鼠HOMA-IR、CRP、LPS均低于HSHF组（ P<0.05）；与干预I组相比，干预II组大鼠HOMA-IR、CRP、LPS显著减少（P<0.05）。 2.3.盐酸小檗碱、单纯饮食治疗T2DM大鼠后肠道菌群的变化 2.3.1.盐酸小檗碱、单纯饮食治疗T2DM大鼠后革兰氏阴性菌大肠杆菌属的变化：与NC组相比，干预Ⅰ组、干预Ⅱ组大肠杆菌属丰度减少（ P<0.05）；与HSHF组相比，干预Ⅰ组、干预Ⅱ组大肠杆菌属丰度减少（P<0.05）；与干预Ⅰ组相比，干预Ⅱ组大肠杆菌属减少显著（P<0.05）。 2.3.2.盐酸小檗碱、单纯饮食治疗T2DM大鼠后益生菌乳杆菌属和双歧杆菌属的变化：与 NC组相比，干预Ⅰ组、干预Ⅱ组乳酸菌属、双歧菌属丰度增加（P<0.05）；与HSHF组相比，干预Ⅰ组、干预Ⅱ组乳酸菌属、双歧菌属丰度增加（ P<0.05）；与干预Ⅰ组相比，干预Ⅱ组乳酸菌属、双歧菌属丰度增加显著（P<0.05）。 结论： 1.长期高糖高脂饮食引起大鼠体内血LPS水平轻度升高，诱发体内慢性低度炎症，并至肥胖、IR，STZ注射后，胰岛素分泌相对不足，T2DM产生。 2.盐酸小檗碱治疗T2DM大鼠有效，其可能的部分作用机制是通过改善肠道菌群结构，减少血LPS水平进入机体，从而缓解内毒素血症，进而达到治疗T2DM的目的。
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