摘要
目的：从Nrf2信号通路及其所调控的抗氧化酶（MnSOD、HO-1）表达改变的角度探讨DJ-1介导心肌细胞缺氧预适应（HPC）延迟保护的分子机制。 方法：⑴利用亲本H9c2细胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 siRNA细胞，分别经pFlag-hDJ-1重组载体或对照空质粒pFlag瞬时转染24 h后，建立HPC模型；HPC24h后，通过检测以下变化，以求观察DJ-1不同表达水平对HPC预处理H9c2细胞内Nrf2信号通路的影响：Western Blot检测细胞内DJ-1蛋白表达的变化；免疫共沉淀（Co-IP）检测Nrf2-Keap1的解离情况；Western Blot检测Nrf2核转位变化；染色质免疫共沉淀（ChIP）法检测胞核内Nrf2与HO-1及MnSOD基因启动子区内抗氧化反应元件（ARE）结合的变化。⑵利用亲本H9c2细胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1siRNA细胞，分别经pFlag-hDJ-1重组载体或对照空质粒pFlag瞬时转染24h后，建立HPC模型；HPC24 h后，通过Western Blot检测细胞内抗氧化酶（MnSOD、HO-1）蛋白表达的变化，以求观察DJ-1不同表达水平对HPC预处理H9c2细胞内MnSOD、HO-1蛋白表达的影响。⑶利用亲本H9c2细胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 siRNA细胞，分别经pFlag-hDJ-1重组载体或对照空质粒pFlag瞬时转染24h后，各组细胞分别用Nrf2 siRNA或阴性对照siRNA（NC siRNA）转染24 h，随后建立HPC模型；HPC24h后，通过Western Blot检测细胞内Nrf2及抗氧化酶（MnSOD、HO-1）蛋白表达的变化，以求观察Nrf2信号通路的抑制对DJ-1所依赖的HPC上调H9c2细胞内MnSOD、HO-1蛋白表达的影响。⑷利用亲本H9c2细胞以及DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 siRNA细胞，分别经pFlag-hDJ-1重组载体或对照空质粒pFlag瞬时转染24h后，各组细胞分别用Nrf2 siRNA或阴性NC siRNA转染24 h，随后建立HPC延迟保护模型和缺氧/复氧（H/R）损伤模型，通过检测以下变化，以求观察Nrf2信号通路的抑制对DJ-1所介导的HPC延迟保护的影响：MTT法检测各实验组心肌细胞存活率的变化；根据试剂盒说明分别检测各组细胞内LDH活性变化；应用比色法测定MDA含量；流式细胞术检测细胞内活性氧（ROS）含量的变化。 结果：①在H9c2细胞，HPC24h后能显著上调DJ-1蛋白表达，同时促进Nrf2与其抑制蛋白 Keap1解离，并促进 Nrf2入核，增加 Nrf2在胞核内与 HO-1及MnSOD基因启动子区内ARE的结合。然而，在DJ-1低表达的H9c2/DJ-1 siRNA细胞，HPC上述效应被逆转。此外，H9c2/DJ-1 siRNA细胞经pFlag-hDJ-1转染进行回复实验后，DJ-1蛋白表达恢复，同时伴随HPC上述效应的恢复。②在H9c2细胞，HPC24h后能显著上调HO-1及MnSOD蛋白表达。然而，在DJ-1低表达的H9c2/DJ-1 siRNA细胞，DJ-1沉默对HPC所诱导的HO-1及MnSOD蛋白表达上调呈现抑制效应。同样，H9c2/DJ-1 siRNA细胞经pFlag-hDJ-1转染后，HPC上调HO-1及MnSOD蛋白表达的效应也被恢复。③H9c2细胞经Nrf2 siRNA处理后产生DJ-1沉默相似效应，对HPC所诱导的HO-1及MnSOD蛋白表达上调呈现抑制效应。更为重要的是，H9c2/DJ-1siRNA细胞经pFlag-hDJ-1转染后，HPC上调HO-1及MnSOD蛋白表达的回复效应也被Nrf2 siRNA所逆转。④在H9c2细胞，HPC24 h后可显著提高H/R损伤心肌细胞的生存率，抑制 LDH的活性；并能显著减少 H9c2心肌细胞 H/R过程中所产生的活性氧（ROS），同时减少MDA的生成。然而，在DJ-1沉默的H9c2/DJ-1 siRNA细胞，HPC上述效应被逆转。更为有趣的是，H9c2细胞经Nrf2 siRNA处理后同样产生DJ-1沉默相似效应，对HPC抗H/R所诱发的氧化应激，产生延迟保护作用呈现抑制效应。此外，在H9c2/DJ-1 siRNA细胞，Nrf2 siRNA也逆转DJ-1表达恢复对HPC延迟保护的回复效应。 结论：DJ-1介导心肌细胞HPC延迟保护的分子机制与其激活Nrf2信号通路，进而上调Nrf2所调控的抗氧化酶MnSOD、HO-1的蛋白表达有关。
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