摘要
Toll样受体是机体内一类重要的病原识别受体，能对入侵机体的病原微生物进行及时的识别，从而启动机体固有免疫应答并影响适应性免疫的产生。本研究首次克隆并报道了四川白鹅Toll样受体家族的TLR7和TLR21的cDNA序列，并进行了生物信息学分析。鹅TLR7包含一个完整的开放阅读框，编码1045个氨基酸，其信号肽位于第1到27位，跨膜区位于第836位到860位，高度保守TIR结构域位于第884位到1034位。鹅TLR21包含一个完整的开放阅读框，编码975个氨基酸，其信号肽位于第1到35位，跨膜区位于第757位到779位，高度保守TIR结构域位于第809位到951位。比较两基因在不同物种之间蛋白二级结构和三级结构，发现物种之间亲缘关系越接近比对相似性越高。 为了得到TLR7和TLR21在鹅体各个组织的分布情况，我们利用半定量RT-PCR和定量RT-PCR方法构建了组织表达谱。整个实验过程中，选择β-actin和GAPDH作为内参基因对实验结果校正检测。我们发现:TLR7的转录水平在雏鹅的法氏囊上最高，且在与免疫功能相关的组织如盲肠，哈德氏腺等也相对较高。值得注意的是，肺脏的相对表达量仅次于法氏囊，说明鹅TLR7与呼吸道疾病或许有紧密联系。比较不同年龄鹅之间免疫组织表达谱后，我们发现无论是成年鹅，还是幼鹅，都在法氏囊和脾脏有稳定的高表达。不同的是，幼鹅以法氏囊，胸腺为主要免疫器官，而或许是随着发育进行，成年鹅则是以外周血，法氏囊和脾脏为主要免疫器官。TLR21的转录水平在鹅的哈德氏腺，胸腺等免疫功能相关组织表达量高。比较不同年龄鹅之间全组织表达谱后，我们发现幼年鹅法氏囊表达最高，而成年鹅法氏囊却只有中等的转录水平，这与TLR7的结果类似，说明鹅免疫分子的在组织中的表达量随个体生长发育而有所变化。总体来讲，TLR7和TLR21都在免疫组织器官中高表达，这与它们发挥的免疫功能密切相关。不同发育阶段鹅TLRs的组织表达差异，也说明了鹅免疫系统随着发育而成熟。 为了验证鹅TLR7和TLR21的免疫学特性，我们选取了几种免疫刺激剂:R848、Imiquimod、Poly(I∶C)和ODN2006。这些刺激剂都是已知证实能被Toll样受体识别，并引发固有免疫反应。其中R848是TLR7和TLR8的刺激剂，Imiquimod是TLR7的刺激剂，Poly(I∶C)是TLR3的刺激剂，而ODN2006则是TLR9和TLR21的刺激剂。通过这些刺激剂处理分离的鹅脾脏淋巴细胞和鹅外周血淋巴细胞，利用定量RT-PCR方法检测TLR7和TLR21是否受刺激而表达上调，同时检测免疫通路下游的促炎性因子IL-6，IL-1β和干扰素IFN-α与IFN-γ的表达情况。整个实验过程中，选择β-actin和GAPDH作为内参基因对实验结果校正检测，并同时以PBS处理鹅脾脏淋巴细胞和鹅外周血淋巴细胞做阴性对照。我们发现:和预期一样，R848和Imiquimod都能引起鹅TLR7的响应，同时TLR7介导固有免疫通路下游的IL-6，IL-1β和IFN-α也都有显著的表达上调。ODN2006能够有效的刺激鹅TLR21的表达并引发下游的IL-6，IL-1β，IFN-α和IFN-γ的显著上调，而Poly(I∶C)作为阳性对照，对TLR7和TLR21表达量无影响，但是上调IL-6和IFN-α的表达，说明或许是鹅TLR3被刺激产生的免疫反应。总体来说，这些刺激剂都能有效地引起鹅脾脏淋巴细胞和鹅外周血淋巴细胞的免疫反应，因此有作为新型鹅疾病防治免疫佐剂的可能。 为了确认鹅TLR7和TLR21参与宿主的抗病毒反应，我们选用新型雏鹅病毒性肠炎病毒(NGVEV)感染分离的鹅脾脏淋巴细胞和鹅外周血淋巴细胞，利用定量RT-PCR方法检测TLR7和TLR21是否受刺激表达上调，同时检测免疫通路下游的促炎性因子IL-6，IL-1β和干扰素IFN-α与IFN-γ的表达情况。整个实验过程中，选择β-actin和GAPDH作为内参基因对实验结果校正检测，并同时以PBS处理鹅脾脏淋巴细胞和鹅外周血淋巴细胞做阴性对照。我们发现:在NGVEV感染之后，鹅TLR7在96h内均无表达上调，而鹅TLR21则能被刺激，并由此介导下游的IL-6，IL-1β，IFN-α和IFN-γ的表达上调。因此，有效的刺激TLR21也许能成为预防NGVEV等病毒感染鹅体的方法，而ODN2006则具备了成为重要的抗病毒免疫效剂的可能。 综上，本研究丰富了鹅体内抗病毒固有免疫反应的基础知识，为进一步深入揭示鹅抗病毒免疫反应相关研究奠定基础，并为鹅疾病的防治提供参考。
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