摘要
本文主要从以下几个部分展开论述： 第一章 肺肾气（阳）虚型哮喘患者炎症与HPA轴功能状态及相关性研究 目的:通过对比不同中医辨证分型的哮喘患者及正常健康人的血清、诱导痰、唾液、尿液中有关气道炎症、HPA轴功能的指标，拟明确肺肾气（阳）虚型哮喘患者炎症及HPA轴功能状态，为补肾益气方药干预哮喘的内在机理研究提供依据。 方法:选取年龄18-65岁，性别不限，现代医学诊断为哮喘，中医辨证为肺肾气（阳）虚、肺气虚、阴虚火旺证;另选取年龄、性别匹配的健康人群作为对照组。同时排除合并肺部其他疾病的患者;一个月内使用糖皮质激素治疗的患者。在固定时间点采集所有研究对象外周血、诱导痰、唾液、24h尿液，用Bio-Plex悬液芯片检测痰上清液和血清中白细胞介素(Interleukin，IL)-6、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor，TNF-α)、转化生长因子-β(Transforming GrowthFactor-β，TGF-β)、干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)水平等以观察炎症情况;同时用放射免疫法检测血浆及唾液皮质醇，24h尿游离皮质醇(Urinary Free Cortisol，UFC)、17-羟皮质类固醇（尿17-羟）、17-酮类固醇（尿17-酮）等指标以评估HPA轴功能。 结果:本研究共收集71例哮喘患者，其中肺肾气（阳）虚组28例，肺气虚组23例，阴虚火旺组20例，另选取41名健康体检者作为正常组。各组患者性别、年龄、体重指数、吸烟、病程、疾病严重程度均无统计学差异(P＞0.05)。与正常组、肺气虚组比较，肺肾气（阳）虚组、阴虚火旺组血清TNF-α水平明显升高，而IFN-γ明显降低(P＜0.05)，肺肾气（阳）虚组IL-6水平明显高于其他三组(P＜0.05)。与正常组、肺气虚组比较，肺肾气（阳）虚组诱导痰中TNF-α、TGF-β水平明显升高(P＜0.05)，阴虚火旺组诱导痰IFN-γ明显降低(P＜0.05)。肺肾气（阳）虚组尿游离皮质醇、17-羟水平明显低于其他三组，尿17-酮明显低于正常组及阴虚火旺组。与正常组、阴虚火旺组相比，肺肾气（阳）虚组晨8点及次日8点血皮质醇明显降低(P＜0.05);与正常组比较，肺肾气（阳）虚组晨8点及次日8点唾液皮质醇明显降低(P＜0.05)，与阴虚火旺组比较，肺肾气（阳）虚组次日晨8点唾液皮质醇明显降低(P＜0.05);肺气虚组亦出现血浆及唾液中晨8点及次日8点皮质醇水平降低，但与正常组比较无统计学差异。血清TNF-α、IL-6与血浆皮质醇呈明显的负相关(r=-0.26，P=0.03)、(r=-0.25，P=0.03)，诱导痰IL-6与唾液皮质醇呈明显的负相关(r=-0.26，P=0.02)。血清IFN-γ与尿17-羟呈明显的正相关(r=0.21，P=0.03)。 结论:哮喘患者致炎因子增多，抑炎因子缺乏，处于致炎/抑炎平衡调控机制失衡状态，其中以肺肾气（阳）虚型哮喘患者改变尤为明显，可能与其HPA轴功能低下或紊乱有关。 第二章 补肾益气方药治疗肺肾气（阳）虚型哮喘的临床疗效观察及内在机理探讨 目的:通过多中心、随机、双盲的临床试验，验证并对比补肾防喘片与补肾益气方治疗肺肾气（阳）虚型哮喘的疗效，并从炎症、HPA轴功能角度出发探讨其内在机理，为临床应用提供循证医学证据。 方法:采用前瞻性、多中心、双盲的随机对照试验方法。受试对象来源于5家三级甲等医院门诊与病房，采用相同的入选和排除标准，将符合标准的哮喘患者随机分为补肾防喘片组、补肾益气方组、安慰剂组，三组在现代医学基础治疗上，分别加用补肾防喘片与补肾益气方模拟剂、补肾益气方与补肾防喘片模拟剂、补肾益气方模拟剂与补肾防喘片模拟剂，观察周期为3个月。 结果:(1)最终共纳入符合标准的患者295例。三组病例治疗前资料具有可比性(P＞0.05)。 (2)三组服药前后安全性指标组间比较，P＞0.05，不良事件/不良反应发生率组间比较，P＞0.05，无严重不良事件报告。 (3)补肾防喘片、补肾益气方治疗后血EOS明显下降，但与安慰剂组比较，无统计学差异(P＞0.05);补肾益气方治疗后血清t IgE有明显下降趋势，而补肾防喘片组、安慰剂组治疗后升高，组间比较无统计学差异(P＞0.05);补肾益气方治疗后IL-2、IL-10水平升高，与补肾防喘片组、安慰剂组比较，有显著统计学差异(P=0.006，P=0.04);补肾益气方、补肾防喘片服药后血清中IFN-γ水平降低，与安慰剂组比较，有统计学差异(P=0.01);补肾益气方、补肾防喘片治疗后血清MMP-9、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17水平较服药前均有明显下降，且下降幅度比安慰剂组明显，但组间比较无统计学差异(P＞0.05);补肾益气方治疗后血浆CRH、ACTH、皮质醇水平均有明显升高，补肾防喘片治疗后血浆ACTH水平亦有升高的趋势，而安慰剂组治疗后均下降。 结论:补肾防喘片可显著升高FEV1占预计值％，补肾益气方亦有改善FEV1占预计值％的趋势;观察期间由于各组均在吸入糖皮质激素治疗的基础上，补肾防喘片和补肾益气方减少哮喘急性发作的作用不明显，但补肾益气方与补肾防喘片治疗后均有改善肺功能，提高哮喘控制水平，减轻日间哮喘症状，提高生活质量，改善肺肾气（阳）虚证候的作用;机理研究表明降低致炎因子水平，升高抑炎因子水平，纠正致炎/抑炎平衡调控机制失衡，改善HPA轴功能，提高内在抗炎能力可能是补肾防喘片、补肾益气方治疗肺肾气（阳）虚型哮喘的内在机理;补肾防喘片与补肾益气方是治疗哮喘安全可靠的中成药，值得在临床上推广应用。 第三章 补肾益气方药治疗肺肾气（阳）虚型哮喘的药效物质基础研究 目的:利用HPLC-ESI/Q-TOF-MS/MS快速鉴别补肾防喘片中化学成分，结合动物实验研究，初步明确补肾益气方药治疗肺肾气（阳）虚型哮喘的活性成分。 方法:1.补肾防喘片中化学成分鉴别:采用Agilent Poroshell120-C18反相色谱柱，以乙腈-0.1％甲酸为流动相梯度洗脱;质谱使用ESI，在正离子、负离子、紫外线模式下采集数据。 2.淫羊藿苷对社交应激性“恐伤肾”致肺肾气虚哮喘小鼠的干预作用及内在机制探讨:将45只Balb/c小鼠按随机数字法分为5组，每组9只，即正常组、“恐伤肾”致肺肾气虚哮喘组、地塞米松干预组、低剂量淫羊藿苷干预组、高剂量淫羊藿苷干预组。各用药组分别在OVA雾化前30min灌胃给药，连续14天。检测指标同第三章方法2。 结果:1.通过正、负离子质谱信息及元素组成分析并结合对照品及相关文献数据对照，共鉴定出淫羊藿苷等18个化学成分; 2.旷场试验结果显示，与肺肾气虚哮喘模型组比较，淫羊藿苷组小鼠中央格停留时间延长(P＜0.05)，垂直活动增加(P＜0.05)，水平运动、粪便次数明显减少(P＜0.05)，地塞米松干预亦有类似作用，但不如高剂量淫羊藿组改善明显;肺功能结果提示，与肺肾气虚哮喘组比较，淫羊藿苷与地塞米松干预组，在Mch高浓度激发时，RL明显下降(P＜0.05)，其中以高剂量淫羊藿苷RL下降最明显;淫羊藿苷与地塞米松治疗组可抑制肺肾气虚哮喘组血清及BALF中炎症因子水平的升高(P＜0.05)，高剂量淫羊藿苷与地塞米松作用相当或优于地塞米松，但两组之间无统计学差异;淫羊藿苷与地塞米松干预可抑制肺肾气虚哮喘组血清皮质酮水平升高(P＜0.05);淫羊藿苷与地塞米松干预可明显减轻肺肾气虚哮喘组气道炎细胞浸润、水肿、上皮损伤情况(P＜0.05)，其中以高剂量淫羊藿苷改善最明显;淫羊藿苷治疗组小鼠体外LPS诱导的脾脏单个核细胞增殖及分泌的细胞因子能被高浓度皮质酮所抑制，而地塞米松干预组此作用不明显;淫羊藿苷干预后肺组织GR mRNA与GR蛋白表达水平显著升高(P＜0.01)，呈剂量依赖性，而地塞米松治疗组有升高肺肾气虚哮喘组小鼠肺组织GR蛋白表达的趋势，但无统计学差异。 结论:1.通过高效液相色谱分离，质谱测定相对分子质量及相关文献数据检索确定补肾防喘片中的18种化学成分，其中淫羊藿苷等5种单体成分来自补肾中药淫羊藿，这为阐明补肾益气方药的药效物质基础研究提供了证据。 2.淫羊藿苷对肺肾气虚哮喘小鼠行为学、AHR、气道炎症等指标的改善作用呈剂量依赖性，并且高剂量淫羊藿苷作用优于地塞米松，其作用可能是通过调整HPA轴功能、调节免疫、上调GR mRNA转录及蛋白表达途径实现的，淫羊藿苷可能是补肾防喘片治疗肺肾气（阳）虚型哮喘的主要活性成分之一。
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