摘要
目的: 1.结合国外胆道闭锁(BA)肝脏病理半定量标准，初步建立我国相应的BA肝脏病理半定量评分标准以及预后指标，探讨肝脏病理学半定量评分系统在BA术前早期诊断中的价值，分析肝脏病理评估参数与BA预后的相关性，为BA预后的判断提供可靠依据; 2.研究热休克蛋白47(HSP47)在BA患儿肝脏组织及血清中的表达变化，分析HSP47与BA肝组织纤维化程度的相关性，探讨HSP47作为BA预后随访指标的可行性。 方法: 一、胆道闭锁(BA)肝脏病理学评分的诊断价值及与预后相关性探讨: 1.病例入组标准及预后评估标准:收集复旦大学附属儿科医院外科2012年6月至2013年7月间收治入院手术的96例梗阻性黄疸患儿入组，根据术中胆道造影诊断结果将患儿分为BA组共58例（Ⅲ型）与非BA组共28例（除外PFIC、胆道发育不良、Allagie综合征）。分别记录各组病例性别、年龄、术前与术后肝功能及术后随访等临床资料。同时选取入组病例术后肝脏组织苏木精—伊红(hematoxyl in-eosinstaining，HE)染色病理切片各1张并随机编号，由一名对诊断结果未知的专业病理医师解读病理切片，运用基于8个病理特征（肝脏纤维化、胆小管增生、汇管区胆栓形成、胆汁淤积、肝细胞病变、汇管区炎症细胞浸润、髓外造血、胆管板发育异常），总分为21分的半定量肝脏组织病理评分系统对各组病例肝脏的相关病理特征进行半定量评分，记录得分，做出病理诊断。同时根据BA患儿术后半年血胆红素水平，将入组BA忠儿再分为预后良好组（胆红素降至正常水平）与预后不良组（胆红素高于正常水平）。 2.比较各组病例肝脏组织病理诊断与术中胆道造影诊断符合率，并分析BA患儿肝脏组织相关病理特征与其预后相关性。 二、热休克蛋白47(HSP47)在BA患儿肝脏组织及血清中的表达变化及其与BA患儿肝纤维化程度相关性研究: 分别选取20例BA、10例胆汁淤积、10例胆总管囊肿术中活检的肝脏组织及术后肝脏组织病理切片，应用荧光定量RT-PCR和western blot检测各组肝脏组织中HSP47mRNA及蛋白水平表达量变化;同时根据Okhuma‘s分级标准，光学显微镜下观察各组病例肝脏组织HE染色病理切片，比较各组肝组织纤维化程度;此外，运用ELISA实验检测比较各组患儿血清中HSP47蛋白表达水平变化。分析HSP47与BA肝脏纤维化程度相关性。 结果: 一、胆道闭锁(BA)肝脏病理学评分的诊断价值及与预后相关性探讨: 1.入组96例梗阻性黄疸患儿，根据术中胆道造影诊断，共有58例BA（男性33例，女性26例）及28例胆汁淤积症（男性22例，女性6例），两组患儿平均年龄及性别比无明显差异。BA组患儿总胆红素、碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶及胆汁酸水平分别为173.9±66.4，605.0±223.4，171.4±114.3，111.9±85.5，与胆汁淤积症组患儿相比，均无显著差异(157.8±64.5，603.6±301.3，140.5±105.7，129.8±116.2)，而BA组患儿谷氨酰转肽酶及直接胆红素水平较胆汁淤积组显著较高(859.2±688.5 vs.404.1±400.2，P＜0.01;134.2±50.1vs.110.5±41.8,P＜0.05)。 2.依据肝脏组织病理学评分（8个特征-21分制），BA组肝脏组织病理学平均评分分值明显高于胆汁淤积组(10.9±2.2 vs.5.9±1.3，P＜0.001)。ROC曲线分析发现依据肝脏组织病理学评分系统，当评分分值≥8分时，诊断BA的机率随着分值的升高而逐渐增加，其诊断敏感度和特异度分别为93.1％和99.8％，当评分分值＜8分时，诊断胆汁淤积而非BA得机率则随着分值的升高而逐渐增加，诊断的敏感性和特异度分别为85.7％和99.9％。总体上使用肝脏组织病理学评分系统诊断BA的敏感性、特异性及准确率分别为94.7％、86.2％和91.9％，明显高于传统BA病理诊断方法(敏感性、特异性及准确率:86.4％、74.1％及82.6％;P＜0.01)。 3.BA组肝脏组织病理学评分分值大小与BA患儿性别、总胆红素水平、总胆汁酸无明显相关性(r1=-0.14，P1＞0.05;r2=0.181，P2＞0.05;r3=0.103，P3＞0.05)，而与BA患儿的年龄分布、直接胆红素水平及谷氨酰转肽酶水平呈正相关，(r1=0.289，P1＜0.01, r2=0.272，P2＜0.01, r3=0.367，P3＜0.01)。 4.所有BA组患儿均存在不同程度的肝脏组织纤维化，以中度肝脏纤维化以上为主，肝纤维化率及程度较胆汁淤积组明显，后者仅有14.2％患儿存在轻度肝脏组织纤维化;BA组胆管增生率为92.1％，较胆汁淤积组(25％)明显升高;胆栓形成及胆管板发育异常仅见于胆道闭锁组，发生率分别为51.7％％和17.2％，(vs.胆汁淤积组，P＜0.01)。肝脏纤维化与患儿年龄呈正相关，纤维化程度越严重，提示远期预后不佳。 二、热休克蛋白47(HSP47)在BA患儿肝脏组织及血清中的表达变化及其与BA患儿肝纤维化程度相关性研究: 1.BA组肝脏组织中HSP47 mRNA水平相对表达量为0.915±0.730较胆汁淤积组及胆总管囊肿组显著增高（0.066±0.037与0.314±0.150，P＜0.05）;同时HSP47蛋白在BA组肝脏组织中的表达水平明显高于胆汁淤积组及胆总管囊肿组。 (3.06181±0.504763 vs1.358018±0.373174,3.06181±0.504763 vs1.23649±0.350173)，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 3.BA组患儿血清中HSP47蛋白平均浓度为63.38±17.11，均高于胆汁淤积组(57.87±14.83)及胆总管囊肿组(45.78±11.23)。 4.BA组肝脏组织中HSP47 mRNA，蛋白水平表达量与HSP47血清浓度间呈正相关(mRNA水平VS蛋白水平r=0.836，P＜0.05，蛋白水平VS血清浓度r=0.989，P＜0.01，mRNA水平VS血清浓度r=0.883，P＜0.05)。 5.结合光镜下观察肝脏组织HE染色切片按照Okhuma‘s肝纤维化分级标准进行肝纤维化程度分级情况，血清HSP47的表达与肝纤维化程度成正相关，具有统计学意义（r=0.669，P＜0.01）。与术后半年内胆红素指标是否降至正常内关系不显著，不具备统计学意义，根据随访至今存活情况行Logic回归分析，血清HSP47的表达与术后生存情况存在相关性（x2=5.417，P=0.02＜0.05）。 结论: 1.肝组织病理评分（8个特征-21分制）对于BA诊断及BA与其他胆汁淤积症间的鉴别诊断较以往的病理诊断方法具有更高的敏感性、特异性和准确性。 2.通过肝脏病理评分系统分析相关病理特征的程度与胆道闭锁患儿预后情况，具备可行性。 3.热休克蛋白47在肝脏组织及血清表达具有一致性，表达量与肝脏纤维化程度呈正相关，能够提示胆道闭锁患儿肝脏纤维化程度。 4.血清热休克蛋白47的表达情况可能作为随访BA患儿远期预后的监测指标。
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