摘要
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种以认知功能障碍为特征且与年龄有关的神经退行性疾病，会给病人和家属带来毁灭性的打击，造成巨大社会负担。目前AD的发病形势严峻且中晚期疗效不佳，因此，深入探讨其发病机制及寻找有效的早期防治措施已成为当前研究的重点。 AD按发病年龄可分为早发型AD（＜65岁）和晚发型AD(＞65岁);根据有无家族遗传史分为家族性AD和散发性AD。家族性AD多为早发型，且发病率不到10％，其发病与β-淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein，APP)基因、早老素1（Presenilin1，PS1）基因和早老素2(Presenilin2，PS2)基因突变有关;晚发型AD占AD总数绝大部分。目前AD的发病机制以β-淀粉样蛋白(β-amyloidprotein，Aβ)级联假说为主，该假说认为Aβ是AD发病的起始因子，由β分泌酶裂解APP产生。Aβ的产生与清除失衡导致其在脑内过量生成、聚集和沉积，导致以Aβ为核心的老年斑的形成、Tau蛋白高度磷酸化、神经纤维的缠结、神经元炎症、神经元的功能丧失或死亡，从而出现中枢整合功能失常促使AD发生。正常情况下，机体依靠蛋白酶降解、细胞内吞、转运出脑等清除机制来平衡Aβ的产生。Aβ清除机制的失常被认为是是晚发型AD脑内Aβ积累的重要原因。 脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase，LPL)参与细胞调节的Aβ内吞清除过程，有助于星形胶质细胞和小胶质细胞对Aβ进行摄取和清除，在抗AD中发挥重要作用。LPL是脂肪酶家族的一个成员，能够水解血浆脂蛋白颗粒中的甘油三酯，而且参与细胞对脂蛋白进行摄取。LPL主要分布于脂肪和肌肉，在脑内也高度表达，且在AD患者脑内老年斑周围可见聚积。LPL作为一种新型的Aβ结合蛋白，通过与细胞表面分子糖胺聚糖结合，促使星形胶质细胞对Aβ进行摄取。 细胞内产生的Aβ，或者细胞外的Aβ与细胞膜上受体结合内吞入细胞后，通过自噬体-溶酶体系统降解。自噬是一种能够清除功能失常细胞器和异常蛋白质的重要机制，自噬被诱导后，异常物质会被双层膜样结构的自噬泡包裹，而后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，最后由溶酶体降解其底物。在APP过表达细胞株及AD动物模型中，APP和Aβ能与自噬泡共聚集，即Aβ是自噬底物。在8周龄的APP/PS1转基因动物和发病早期的AD患者脑组织中，均发现了大量自噬泡。长期应用自噬诱导剂如雷帕霉素可以改善AD动物模型Aβ和Tau蛋白的病理及行为学表现。可见，自噬在AD中十分重要，调节自噬可减少Aβ等毒性蛋白的累积，从而减缓或阻止AD的发生发展，为AD的治疗提供新的可能。 目前，寻找相对安全的天然活性成分来清除Aβ以达到早期防治AD具有重要意义。二烯丙基二硫化物(Diallyl disulfide，DADS)是大蒜中的主要有效成分，具有抗神经炎活性，能保护受到氧化应激损伤的神经细胞，而且能减少Tg2576(APPswe)转基因小鼠脑内可溶性和纤维化Aβ，从而减少老年斑数量，但具体机制不详。研究发现，DADS能够上调3T3-L1脂肪细胞中脂肪形成相关基因LPLmRNA的表达。DADS能否通过调节AD模型小鼠脑内LPL mRNA及蛋白表达和自噬水平，进而减少Aβ沉积，目前尚未见报道。 目的： 本研究采用APPswe/PS1 dE9双转基因小鼠，通过Morris水迷宫和旷场试验分析DADS对AD模型小鼠神经行为的影响，并观察脑内Aβ沉积情况、LPL mRNA及蛋白表达和自噬水平的变化，探讨其干预作用机制，为寻找防治AD的有效措施提供理论依据。 方法： 一、动物分组、处理及样品采集 将APPswe/PS1dE9双转基因雄性小鼠与C57BL/6J雌性小鼠杂交，子鼠4周龄时剪鼠尾用于基因型的鉴定。选择鉴定出的20只5月龄APPswe/PS1dE9双转基因小鼠按窝别及体重随机分为AD模型组和AD干预组，同时将同窝出生的野生型小鼠分为野生对照组和野生干预组，每组10只，雄鼠6只，雌鼠4只。参照文献，以50mg/kg DADS每日1次经口灌胃干预组小鼠（食用油作为溶媒），AD模型组和野生对照组小鼠灌胃等量食用油，连续处理6个月，实验期间小鼠自由摄食及饮水，定期观察小鼠的一般状况，并每周称量体重1次。实验末期进行神经行为学测试后，小鼠禁食12h，称重，乙醚麻醉后处死，冰上剥离脑组织并称量脑重，左侧大脑皮质用于测定LPL mRNA及蛋白表达水平;右侧半脑固定于4％多聚甲醛液，石蜡包埋后行冠状位连续切片，用于分析脑组织Aβ沉积及自噬泡的情况。 二、检测指标及方法 （一）APPswe/PS1 dE9双转基因小鼠基因型的鉴定 提取鼠尾DNA，采用PCR法鉴定APPswe/PS1 dE9双转基因小鼠的基因型。 （二）一般状况、体重及脑系数 每日观察各组小鼠的自主活动、反应性、毛须光泽及死亡情况等，分析整个受试期间小鼠体重变化，并按下述公式计算脑系数: 脑系数(mg/g)=脑质量(mg)/体重(g) （三）神经行为学 采用Morris水迷宫判断小鼠学习记忆和空间定向及认知功能;以旷场试验观察小鼠适应新环境的空间认知与自主探索能力以及精神紧张度。 （四）脑组织Aβ沉积 采用免疫组化法检测各组小鼠大脑皮质和海马Aβ沉积情况。 （五）大脑皮质LPL mRNA及蛋白水平 提取30mg左侧大脑皮质总RNA，以β-actin为内参，SYBR GreenⅠ嵌合染料法对目的基因进行Real-time RT-PCR，分析LPL mRNA的相对表达水平。提取50 mg左侧大脑皮质总蛋白，以β-actin为内参，Western blot法检测LPL蛋白的相对表达水平。 （六）脑组织自噬水平 吖啶橙荧光染色法观察大脑皮质和海马自噬泡的变化。 三、统计分析 采用SPSS16.0统计软件对实验数据进行分析，数据均符合正态分布，实验结果用(x)±s表示，进行单因素方差分析(ANOVA)。满足方差齐性时，两两比较采用LSD;不满足方差齐性时，两两比较采用Durnett's T3法。检验水准:α=0.05。 结果： 一、APPswe/PS1dE9双转基因小鼠基因型的鉴定 成功繁育了APPswe/PS1dE9双转基因AD模型小鼠。 二、一般状况、体重及脑系数 整个受试期间，AD干预组有1只雌鼠于受试第3周死亡，其他各组小鼠未见异常表现及死亡。各组小鼠体重、脑重及脑系数之间的差异均无统计学意义(P＞0.05)。 三、神经行为学 水迷宫试验结果显示，与野生对照组相比，AD模型小鼠逃避潜伏期延长，空间探索次数减少，差异均有统计学意义(P＜0.01);与野生干预组相比，AD干预组小鼠逃避潜伏期延长，空间探索次数减少，差异均有统计学意义(P＜0.05);与AD模型组相比，AD干预组小鼠逃避潜伏期缩短，空间探索次数增多，差异均有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。野生干预组和AD干预组与野生对照组相比，小鼠水迷宫试验的检测结果均未见统计学差异（P＞0.05）。 旷场试验结果显示，与野生对照组相比，AD模型组小鼠中央格停留时间延长，穿格次数减少，直立次数减少，差异均有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05);与AD模型组相比，AD干预组小鼠中央格停留时间缩短，穿格次数增加，直立次数增加，差异均有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05);与野生对照组和野生干预组相比，AD干预组小鼠中央格停留时间延长，差异均有统计学意义(P＜0.01)。野生干预组和AD干预组与野生对照组相比，小鼠穿格次数和直立次数的检测结果均未见统计学差异(P＞0.05);AD干预组与野生干预组相比，小鼠穿格次数和直立次数的检测结果均未见统计学差异（P＞0.05）。 四、脑组织Aβ沉积 与野生对照组相比，AD模型组小鼠海马、大脑皮质Aβ斑块数量均增多，差异均有统计学意义(P＜0.01);AD干预组小鼠海马、大脑皮质Aβ斑块均少于AD模型组，差异均有统计学意义(P＜0.01)。野生干预组和AD干预组与野生对照组相比，小鼠海马和大脑皮质Aβ斑块数量均未见统计学差异(P＞0.05);与野生干预组相比，AD干预组小鼠海马和大脑皮质Aβ斑块数量均未见统计学差异（P＞0.05）。 五、大脑皮质LPL mRNA及蛋白水平 与野生对照组相比，AD模型组和AD干预组小鼠大脑皮质LPL mRNA水平均升高，差异有统计学意义(P＜0.01);与野生干预组相比，AD干预组小鼠大脑皮质LPL mRNA水平升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。AD干预组与AD模型组相比，小鼠大脑皮质LPL mRNA水平未见统计学差异(P＞0.05);野生干预组与野生对照组相比，小鼠大脑皮质LPL mRNA水平未见统计学差异(P＞0.05)。 与野生对照组相比，AD模型组小鼠大脑皮质LPL蛋白表达降低，差异均有统计学意义(P＜0.05);AD干预组小鼠大脑皮质LPL蛋白表达高于AD模型组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。野生干预组和AD干预组与野生对照组相比，小鼠大脑皮质LPL蛋白表达未见统计学差异(P＞0.05);与野生干预组相比，AD干预组小鼠大脑皮质LPL蛋白表达未见统计学差异（P＞0.05）。 六、脑组织自噬水平 与野生对照组相比，AD模型组小鼠海马、大脑皮质自噬泡的平均光密度值升高，差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05);与AD模型组相比，AD干预组小鼠海马、大脑皮质自噬泡的平均光密度值降低，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。野生干预组和AD干预组与野生对照组相比，小鼠海马、大脑皮质自噬泡的平均光密度值未见统计学差异(P＞0.05);与野生干预组相比，AD干预组小鼠海马、大脑皮质自噬泡的平均光密度值未见统计学差异(P＞0.05)。 结论： AD模型小鼠认知能力下降，脑内Aβ沉积增加及自噬水平上调，大脑皮质LPL mRNA水平升高而蛋白表达降低;DADS可减少该模型小鼠脑内Aβ沉积，下调自噬水平及上调大脑皮质LPL蛋白表达，改善认知功能，而对LPL mRNA水平未见明显改变。
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