摘要
脊髓缺血再灌注损伤（Spinal Cord ischemia reperfusion injury, SCIRI）[1]是指去除脊髓缺血诱因后，脊髓恢复血供，神经功能不仅没有改善，反而在原来损伤的基础上进一步加重，甚至出现不可逆性神经元迟发性死亡的现象。脊髓损伤分为原发性损伤和继发性损伤[2]。原发性损伤是指脊髓最初由致伤机械力或缺血造成的局部组织细胞死亡、血管和纤维组织断裂等破坏;而继发性损伤发生于原发性损伤后，主要表现为损伤区的不断扩大，包括氧自由基、炎症介质的产生、血管活性物质的释放、蛋白质合成障碍、离子平衡失调，以及释放细胞因子诱导神经细胞凋亡等多种病理变化，损伤的范围和程度远大于原发性损伤。因此，研究脊髓继发性损伤的病理机制，探索促进脊髓损伤后神经功能修复一直是医学界极具挑战性的难题。 脊髓小胶质细胞(Microglia ce ll，MC)起源于间充质中胚层的巨噬细胞，在胚胎发育期进入中枢神经系统，在血脑屏障(Blood-brain barrier, BBB)形成之后留存，表面表达多种天然免疫受体，是中枢神经系统固有的免疫效应细胞和炎性反应的主要执行细胞。小胶质细胞功能类似于巨噬细胞，具有免疫监视、炎症调理和识别吞噬等功能[3,4]。通常脊髓小胶质细胞处于静息状态起免疫监视的作用。当中枢神经系统发生损伤或炎症时，脊髓小胶质细胞迅速活化，富集于损伤区及其周围，外形由静息多分支样转变成变形虫样，更接近巨噬细胞，能够吞噬崩解的髓鞘和坏死的细胞碎片，提呈抗原介导免疫反应以及分泌多种神经营养因子，促进神经组织的修复和再生。离体实验还证实小胶质细胞活化后其表面受体也会发生显著变化如:上调补体受体及主要组织相容性复合体，同时释放出基质金属蛋白酶(MMPS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白细胞介素(IL-1)，一氧化氮(NO)等物质，趋化巨噬细胞和淋巴细胞向病灶聚集，加重炎症反应和神经细胞的凋亡，具有潜在的神经毒性，可能参与神经元迟发性损伤[5]。目前关于脊髓小胶质细胞在神经损伤和修复过程中的“双刃剑”作用尚不清楚。可能与小胶质细胞通过Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)识别病原，参与抗原递呈产生固有免疫有关[6，7]。TLRs是含有高度保守序列的天然免疫受体家族，可以识别外来病原体和内源性配体例如细胞降解产物、坏死细胞碎片及细胞内特异蛋白等启动机体免疫防御[8]。TLR4是首个被鉴定出来的TLRs家族成员，广泛表达于机体各个系统，作为膜受体“门户”蛋白能够识别生物源性和非生物源性刺激，启动和放大炎性反应和细胞保护不同的信号转导通路，参与机体重要的免疫防御[5]。中枢神经系统中TLR4主要表达在小胶质细胞，越来越多研究证实小胶质细胞及其表面TLRs变化与神经系统发育、修复和再生关系密切，鞘内注射TLR4抑制剂可以降低腰神经损伤模型中脊髓胶质细胞激活、减少促炎因子的释放[9-11]，进一步证实TLR4信号通路在脊髓小胶质细胞参与神经元损伤和修复的传递中发挥重要作用。 脊髓作为联系外周神经系统和高级神经中枢的低级中枢神经系，同样存在血-脊髓屏障(blood-spinal cord barrier，BSCB)，对维持脊髓局部微环境稳定起着非常重要的作用[14]。部分研究指出损伤区细胞微环境的变化可能引起中枢神经系统中小胶质细胞活化。脊髓组织中血管丰富，大量研究证实缺血再灌注损伤过程中血管床直接破坏，以及损伤后炎症反应所致的血管通透性增加都会破坏其完整性，从而加重脊髓组织缺血缺氧、炎症和脊髓血液灌注的改变，同神经元和胶质细胞凋亡以及神经炎症反应一起被并列为三大继发性病理改变[12]。因此，小胶质细胞及其表面TLR4受体的活化在SCIRI中的作用受到越来越多的关注。此外，既往研究报道当损害程度增加时，小胶质细胞及其分泌的基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MMP-9)也参与神经元损伤和凋亡的过程。其中基质金属蛋白酶9(MMP-9)是小胶质细胞分泌的主要蛋白酶类，可以降解多种细胞外基质成份，与多种细胞外间质重塑的正常及病理过程相关，其中基质金属蛋白酶9(MMP-9)可以降解多种细胞外基质成份，最终会导致神经元的变性、坏死[13]。因此，阐明小胶质细胞的初始激活机制，有利于从源头控制继发性炎症反应和潜在的神经毒性作用。七氟烷是一种新型吸入麻醉气体，具有麻醉诱导、苏醒迅速，血流动力学稳定的特点，临床上应用广泛。最近有研究发现七氟烷可以通过类似于缺血预处理(Ischemic preconditioning，IPC)[14]或KATP通道激动剂的机制诱导缺血耐受，减少神经元凋亡，减轻脑缺血/再灌注损伤，具有神经保护作用[15]。但其对脊髓缺血/再灌注损伤是否具有保护作用尚不清楚。 目的： 本研究采用无创动脉夹夹闭主动脉弓合并系统低血压（放血）的方法建立大鼠脊髓缺血/再灌注模型[16]，模拟人体缺血再灌注损伤，从整体、细胞和分子水平上阐明脊髓小胶质细胞、表面受体TLR4活化及其分泌MMP-9在SCIRI继发性损伤过程中与神经功能缺失之间的相关性，探讨七氟烷预处理是否通过调节小胶质细胞表面TLR4受体及其分泌的MMP-9在SCIRI中发挥神经保护作用及其可能机制，为临床防治脊髓缺血再灌注损伤提供新的策略。本实验包括二部分:一、研究小胶质细胞及其TLR4受体在脊髓缺血再灌注损伤中的作用。SCIRI前2天鞘内注射小胶质细胞特异性阻滞剂米诺环素(minocycline)观察SCIRI后Iba-1阳性小胶质细胞的形态变化和分布，观察上述指标变化对BSCB微血管通透性、脊髓水肿和炎性因子释放(NF-κB、TNF-α、IL-1β等)的影响，初步分析小胶质细胞在SCIRI中的作用;SCIRI前2天鞘内注射TLR4特异性阻滞剂和激活剂脂多糖(LPS)，通过双荧光染色观察SCIRI后TLR4表达、TLR4阳性小胶质细胞的分布、对血-脊髓屏障及NF-κB/IL-1β介导的炎症信号通路的，进一步探讨小胶质细胞及其TLR4表达变化与SCIRI相关性及可能机制。二、研究七氟烷预处理在SCIRI中对小胶质细胞及其分泌的MMP-9的调节作用。SCIRI前7天鞘内注射MMP-9 siRNA抑制脊髓组织中MMP-9的表达，荧光双染色观察Iba-1阳性小胶质细胞形态变化和靶向趋化作用（向损伤的神经元迁移）以及对血-脊髓屏障和炎性因子IL-1β的分泌的影响，初步分析小胶质细胞激活及其分泌的MMP-9与SCIRI相关性及可能机制。并于SCIRI前吸入MAC1.0七氟烷60min进行预处理，通过后肢运动功能评分、HE染色和TUNEL染色计数脊髓前角正常神经元和TUNEL阳性神经元，荧光双荧光染色观察小胶质细胞及其分泌MMP-9的水平变化，并在组织学及分子学方面进一步探究七氟烷预处理在SCIRI继发性损伤中发挥神经保护的作用机制。 材料与方法： 一、实验材料 （一）实验动物 健康成年雄性SD大鼠64只，体重200-250g。 （二）主要试剂 伊文思蓝，多聚甲醛，小鼠抗大鼠TLR4多克隆抗体，兔抗大鼠Iba-1，兔抗NF-κB p65多克隆抗体，兔抗GAPDH多克隆抗体，小鼠抗MMP-9单克隆抗体，Alexa fluor594标记的驴抗小鼠抗体，Alexa fluor488标记的驴抗兔抗体，BCA蛋白浓度测定试剂盒，ECL试剂盒，Real-time PCR试剂盒 （三）主要实验仪器 振荡水浴箱、电泳仪、离心机、干燥箱、酶标仪、Real-time PCR扩增仪、Leica SP2共聚焦显微镜、恒冷冰冻切片机、透射电镜 二、实验方法 1、无创动脉夹夹闭主动脉弓合并系统低血压（放血）的方法建立大鼠脊髓缺血/再灌注模型 2、脊髓组织病理学检查，Tarlov评分评价脊髓缺血再灌注损伤对下肢运动神经功能的影响。 3、根据伊文思蓝经微血管外渗到脊髓实质评价BSCB完整性。 4、干湿法测定脊髓含水量，评价脊髓水肿。 5、免疫荧光法测定损伤的脊髓组织中Iba-1、TLR4、NeuN、NF-κB p65和MMP-9的表达。 6、以Iba-1作为小胶质细胞特异性标志，荧光双标染色观察SCIRI后TLR4表达、TLR4阳性小胶质细胞分布。 7、以NeuN作为神经元特异性标志，荧光双标染色观察SCIRI后小胶质细胞及MMP-9的分泌情况、以及活化的小胶质细胞向损伤神经元的趋化作用。 8、Western-blot法测定损伤的脊髓组织中TLR4、Iba-1、核NF-κB p65和MMP-9的蛋白表达。 9、Real time-PCR测定损伤的脊髓组织中TLR4、Iba-1、核NF-κB p65和MMP-9的mRNA表达。 10、ELISA法测定损伤的脊髓组织中IL-1β、CXCL10和CCL2的蛋白表达。 结果： 一、小胶质细胞及其Toll样受体4在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的作用 1、脊髓缺血再灌注损伤后8h、12h、24h和36h大鼠下肢神经功能评分均降低;损伤前3天鞘内注射米诺环素（小胶质细胞抑制剂）、TAK242（TLR4抑制剂）、PDTC(NF-κB抑制剂)可以通过抑制小胶质细胞活性及其TLR4受体功能可以改善神经功能评分。 2、免疫荧光染色表明脊髓缺血再灌注损伤后12h和36h脊髓背角内Iba-1表达阳性的小胶质细胞数量明显增多，外形由静息多分支样转变成变形虫样，损伤前3天鞘内注射米诺环素（小胶质细胞抑制剂）、TAK242（TLR4抑制剂）、PDTC(NF-κB抑制剂)可以抑制Iba-1阳性小胶质细胞的数量和活化。 3、伊文思蓝测定BSCB完整性表明脊髓缺血再灌注损伤后12h和36h伊文思蓝经微血管外渗到脊髓实质，说明BSCB完整性破坏;损伤前3天鞘内注射米诺环素、TAK242、PDTC抑制小胶质细胞及其表面TLR4受体介导NF-κB/IL-1β炎症信号通路可以显著减少伊文思蓝外渗。 4、脊髓缺血再灌注损伤后12h和36h脊髓含水量增加，脊髓水肿;损伤前3天鞘内注射米诺环素、TAK242、PDTC抑制小胶质细胞及其表面TLR4受体介导NF-κB/IL-1β炎症信号通路可以显著减轻脊髓水肿。 5、免疫双荧光染色观察TLR4表达和TLR4阳性小胶质细胞的分布，并用IPP软件计算各组的阳性数目，结果显示脊髓缺血再灌注后12h和36h TLR4的荧光强度明显增加，且主要表达在脊髓背角的小胶质细胞上;损伤前3天鞘内注射米诺环素抑制小胶质细胞活性、TAK242和PDTC抑制TLR4受体介导NF-κB/IL-1β炎症信号均可以减少TLR4的荧光强度和TLR4阳性小胶质细胞的数量。 6、Western-blot和PCR法示缺血再灌注损伤后脊髓组织中TLR4和核NF-κB表达增加，损伤前3天鞘内注射米诺环素、TAK242、PDTC可以抑制TLR4和NF-κB蛋白和mRNA的表达。 7、ELISA法示缺血再灌注损伤后脊髓组织中炎性因子IL-1β表达增加，损伤前3天鞘内注射米诺环素、TAK242、PDTC可以抑制炎性因子IL-1β的释放。 二、七氟烷预处理对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后小胶质细胞活化及金属基质蛋白酶9的影响 1、脊髓缺血再灌注损伤后与Sham组相比，大鼠下肢运动功能Tarlov评分明显降低，HE染色结果示损伤后脊髓前角灰质内有大量空泡形成，正常结构消失，胞质内尼氏体、胞核消失或凝固嗜伊红染的运动神经元，七氟烷预处理可以改善神经功能评分、增加脊髓前角正常神经元数量和改善组织病理学改变。 2、TUNEL染色后的荧光显微照片显示缺血再灌注损伤后脊髓前角灰质内有大量呈绿色荧光TUNEL阳性运动神经元，且免疫双荧光同样显示caspase-3阳性的细胞液主要位于脊髓前角的神经元上，提示缺血再灌注损伤能够导致运动神经元的凋亡;七氟烷预处理可以减少凋亡的神经元的数量。 3、免疫双荧光染色观察MMP-9表达和活化的小胶质细胞分布，并用IPP软件计算各组双标阳性的细胞数目，结果显示脊髓缺血再灌注后36h MMP-9的荧光强度明显增加，且主要表达分布于小胶质细胞的胞浆内;七氟烷预处理可以减少活化的小胶质细胞的数目和MMP-9的分泌;Western-blot法显示脊髓组织中的MMP-9、Iba-1的蛋白表达具有相同的变化趋势。 4、Western-blot显示脊髓缺血再灌注损伤后36h脊髓组织中MMP-9的表达和伊文思蓝渗出量增加，MMP-9分泌增加可以增加其对BSCB基质结构的降解和重塑，破坏BSCB的完整性;七氟烷通过抑制小胶质细胞分泌MMP-9，减轻其对BSCB的破坏，维持BSCB的功能。 5、免疫双荧光染色观察损伤后36h活化的小胶质细胞分布主要向受损的神经元方向迁移和趋化，ELISA显示结果显示脊髓缺血再灌注后炎性趋化因子CXCL10和CCL2明显增加，炎性因子IL-1β的释放增加;七氟烷预处理可以抑制缺血再灌注损伤引起的炎性趋化因子CXCL10和CCL2增加，抑制其对小胶质细胞向损伤的神经元靶向迁移的作用。 结论： 1、脊髓缺血再灌注损伤引起BSCB破坏、神经动能缺失，小胶质细胞表面受体TLR4表达增加，小胶质细胞发生活化。 2、缺血再灌注损伤前2天鞘内注射米诺环素抑制小胶质细胞活性，注射TAK242和PDTC抑制TLR4受体介导NF-κB/IL-1β炎症信号可以改善大鼠下肢神经运动功能、减轻脊髓水肿和炎症反应。 3、七氟烷预处理通过抑制脊髓缺血再灌注损伤引起的炎性趋化因子CXCL10和CCL2增加;抑制趋化因子对小胶质细胞向损伤的神经元靶向迁移的作用，减轻脊髓炎症反应。 4、七氟烷预处理通过抑制脊髓缺血再灌注损伤引起的小胶质活化及其MMP-9的分泌，减少MMP-9对BSCB基质结构的降解和重塑，维持BSCB的完整性，发挥脊髓保护作用。
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