摘要
近年来，随着我国食品行业的飞速发展，食品的数量和种类都得到了突飞猛进的增长，但病原菌引起的食物中毒事件接连发生，当前我国常规微生物检测方法检测耗时长，步骤繁琐、灵敏度低，难以满足检测的需求。在致病菌中其中蜡样芽孢杆菌生长条件宽松，生存范围广，极易污染食物，特别是肉、蛋、奶和它们制成的食品，被人误食后极易引起食物中毒，是人类的一种重要的食源性病原菌。当前，对蜡样芽孢杆菌的检测，我国通常使用传统的国标法，此方法虽然检测结果可靠，但是该试验法在操作步骤繁多，检测出结果的时间长，而新型的快速检测方法，如免疫学方法，聚合酶链式反应，生物传感器技术等等都或多或少存在检测成本高，结果不可靠，或者是对操作人员专业素质要求高等等因素，导致了这些方法不能打规模推广使用。 Notomi T.等人在2000年研发出了环介导等温扩增技术（LAMP），在恒温条件下的高效扩增反应，几十分钟即可完成，其扩增产物既可通过电泳检测，也可以通过加入染料SYBY GreenⅠ后再用肉眼判定结果和焦磷酸镁浊度检测。实时荧光环介导等温扩增反应是在LAMP的基础上发展的一种新的检测技术。基于LAMP反应上的优点，改进了LAMP的缺陷。本研究是根据LAMP的反应原理，在反应体系添加荧光染料，通过反应产物与荧光染料结合发出荧光的特点，利用实时荧光监测仪(ESE-Quant Tube Scanner)进行实时的监控，建立实时荧光环介导等温扩增技术(Real-Time Fluorescence Loop-Mediated Isothermal Amplication，简称RealAmp)检测蜡样芽孢杆菌的方法。 本研究基于蜡样芽孢杆菌的hblA基因序列，利用在线引物设计软件Primer V4设计四条特异性引物。通过体系优化包括Mg2+的添加量、dNTPs的浓度、Bst DNA聚合酶、引物的添加量及内外引物的比例等，扩增条件优化优化了反应温度，利用实时检测仪监测反应进程并给出监测结果。最终优化的反应体系:外引物F3与B3各0.5μL，内引物BIP与FIP2.5μL，MgSO4终浓度1.0 mM，0.3mM dNTPs，10×TheromoPol Reaction Buffer2.5μL，BstDNA聚合酶(8000U)1.5μL，DNA模板2μL，甜菜碱0.5μL，荧光染料0.5μL，ddH2O补足体积到25μμL。扩增反应条件:63℃反应80min。 通过21株致病菌验证RealAmp特异性，结果表明4株蜡样芽孢杆菌结果显示阳性，而其他17株非蜡样芽孢杆菌结果显示均为阴性，说明该试验方法特异性高。并比较了RealAmp与普通LAMP的敏感性，对人工污染的检出限进行了测定，结果表明，该方法对蜡样芽孢杆菌的敏感度达8.2CFU/mL，比普通LAMP高十倍，RealAmp实际样品的检出限为8.2CFU/mL。 结果表明，对蜡样芽孢杆菌检测的方法中，RealAmp检测的方法快速，简单，灵敏度高和特异性强，成本低廉等优点。此方法可以被广泛应用于食品中蜡样芽孢杆菌的检测。
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