摘要
谷胱甘肽(GSH)具有提高机体免疫力清除体内自由基、解毒等重要生理功能，并在氨基酸转运、蛋白修复与合成、DNA合成等方面发挥着巨大作用。因而，筛选富含GSH菌株、挖掘新型双功能GSH合成酶(GshF)、构建高产GSH菌株，尤其是产GSH的乳酸菌工程菌株具有重要应用意义和经济价值。 本研究以构建产GSH的益生性乳酸菌为目标，筛选得到了一株可富集GSH的乳酸菌，并通过微生物生理生化分析、分子生物学方法进行了菌株鉴定，通过克隆和表达该菌株潜在的谷胱甘肽合成酶基因验证了其潜在的GSH合成酶的功能，最后以该菌株为宿主构建了一株具备GSH合成能力的乳酸菌工程菌株。主要结果如下: 以内蒙古奶酪等为目标菌源，采用平板分离获取了一株富含GSH的乳酸菌，其胞内GSH含量高达6.14 mg·g-1（细胞干重）。进一步通过菌株培养特征、生理生化指标考察及16S rDNA等技术，鉴定其为副干酪乳杆菌，并命名为Lactobacillus paracasei LHA4。 为验证L.paracasei LHA4中潜在的GSH合成酶的功能，克隆获取了其的潜在的gshF，并分别构建了基于大肠杆菌及乳酸乳球菌的异源原核表达系统。序列分析表明 GshFLp序列与Pasteurella multocida2000及Streptococcusthermophilus CNRZ1066的GshF序列相似性分别仅为27％与25％;且GshFLp较具有催化活性的GshF短100余个氨基酸。为验证GshFLp功能，分别以pET-28a(+)及pNZ8148为表达载体并构建了重组表达工程菌株E.coli BL21/pET28a-gshFLp和L.lactis NZ9000/pNZ8148-gshFLp。实现了GshFLp于E.coli BL21和L.lactisNZ9000胞内的可溶性表达。然而，纯化于E.coli BL21的电泳纯蛋白和L.lactisNZ9000/pNZ8148-gshFLp的粗酶液均未检测到相应酶活;同时，结合L.paracaseiLHA4的粗酶液亦未能在含有ATP条件下将Glu、Gly和Cys三种前体氨基酸转化为GSH的现象，我们认为，依据生物信息学所推测的潜在的GshFLp不具备合成GSH的能力。 为进一步提升菌株L.paracasei LHA4胞内GSH含量，以本研究室分离的一株具备GSH合成能力的Streptococcus thermophilus基因组为模板，克隆获取该菌株双功能GSH合成酶基因gshFSt，将其构建至乳酸菌组成型表达载体pMG36e，并通过电击转化法导入L.paracasei LHA4感受态细胞中，获取工程菌株:L.paracasei LHA4/pMG36e-gshFst。GSH测定分析表明，与野生菌株L.paracaseiLHA4相比，工程菌胞内GSH含量提升56％。
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