摘要
目的： 大肠埃希菌（Escherichia coli，Ecoli）是临床常见致病菌，分离率在G-菌中居首位。Ecoli的耐药问题一直是临床治疗所面对的重要挑战，尤其当其形成细菌生物膜(Bacteria Biofilm)以后，耐药能力大幅度上升，也为耐药基因的传递和播散创造了条件。 本研究首先对我院住院患者标本中分离得到的Ecoli菌株生物膜形成能力和耐药进行分析，随后观察常用抗菌药物在亚-MIC对ATCC700926和DH5α生物膜形成能力的影响，并以实验中亚-MIC头孢他啶(ceftazidime，CAZ)表现出的生物膜抑制现象为线索，观察亚-MIC CAZ等四种三代头孢菌素对标准菌株和临床分离菌株生物膜形成的影响。选取代表性菌株从细菌耐药表型、药物的稳定性及生物膜形成主要调控基因的变化入手，分析其可能机制发现luxS在药物影响生物膜的过程中转录发生变化，进而通过as-ODN和基因敲除菌株等方法深入研究亚MIC CAZ和CFP调节大肠埃希菌生物膜形成的机制。 方法： 第一部分 大肠埃希菌临床分离株的耐药表型及生物膜形成 1.1 Ecoli生物膜形成的测定 1.1.1 Ecoli生物膜形成半定量检测:采用96孔板结晶紫染色法，酶标仪测定590nm处光密度。 1.1.2Ecoli生物膜形成能力影响因素分析 以Ecoli标准菌株ATCC700926为研究对象，在2种培养基中（LB培养基和M9培养基）、加入3个浓度的初始密度的细菌(106 CFU/L、107 CFU/L、108 CFU/L)、在4个培养时程(6h、12h、18h、24h)观察生物膜形成。采用公式BF=(AB-CW)/G评价生物膜形成能力（公式中AB为细菌生物膜测定值，CW为染色本底，G为细菌光密度测定值，以OD600nm表示）。 第二部分 亚-MIC头孢他啶等抗菌药物对大肠埃希菌生物膜形成的影响 2.1亚-MICs抗菌药物对Ecoli生物膜形成的影响 以Ecoli标准菌株ATCC700926和DH5α为研究对象，评价1/4 MIC9种抗菌药物(CXM、CAZ、FEP、PIP、AMI、TOB、CIP、ERY、TE)对Ecoli生物膜形成的影响。按实验药物分组，设置阴性对照组（不加药）。采用96孔板结晶紫染色法，培养24h检测。 2.2亚-MIC CAZ和CFP影响Ecoil生物膜形成的剂量-效应和时间-效应分析； 第三部分 亚-MIC头孢他啶和头孢哌酮影响大肠埃希菌生物膜形成的机制初探 3.1CAZ和CFP对Ecoli生物膜的影响与细菌耐药和耐药基因的相关性 3.2CAZ和CFP影响生物膜形成作用过程中的稳定性研究 第四部分 亚-MIC头孢他啶和头孢哌酮通过luxS/AI-2群体感应系统调节大肠埃希菌生物膜形成的机制研究 4.1亚-MIC CAZ、CFP对Ecoli生长的影响 以分光光度法检测细菌生长数量，分别于0，4，8，12，16，20和24h时间点取样100μl，检测OD600nm，绘制生长曲线。每个菌株均分为对照组、CAZ组和CFP组3组。 4.2荧光定量PCR检测luxS mRNA的变化 按照TRNzol总RNA提取试剂说明书提取RNA。参考genebank大肠杆菌MG1655基因全序列(NC_000913)，采用Genne Tool软件设计引物。采用SYBR green法进行荧光定量PCR，参照试剂盒说明书进行。 结果： 第一部分 大肠埃希菌临床分离株的耐药表型及生物膜形成 1.1Ecoli临床分离株的生物膜形成能力 1.1.1Ecoli生物膜形成能力影响因素分析 Ecoli在LB培养基中，初始细菌浓度108/L培养24h生物膜形成能力最强。 1.1.2Ecoli临床分离株的生物膜形成能力 绝大部分Ecoli临床株可形成生物膜，其中81.0％(51/63)具有中等以上生物膜形成能力，14.3％(9/63)的菌株生物膜形成能力较弱，仅有3株菌不形成生物膜。 第二部分 亚-MIC头孢他啶等抗菌药物对大肠埃希菌生物膜形成的影响 2.1亚-MICs9种抗菌药物对EColi ATCC700926和DH5α生物膜形成的影响 1/4MIC CAZ可抑制ATCC700926生物膜形成，其余抗菌药物对ATCC700926和DH5α生物膜形成无影响。 2.2亚-MICs CAZ等抗菌药物对EColi生物膜形成的影响 结果显示，1/4 MIC CAZ可抑制包括ATCC700926在内的12.7％(8/63)Ecoli菌株生物膜形成;1/4 MIC CFP可诱导33.3％(21/63) Ecoli生物膜形成。头孢曲松（Ceftriaxome，CTR）和头孢噻肟(Cefotaxime，CTX)对Ecoli生物膜形成未表现出明显的抑制或者诱导作用。 第三部分 亚-MIC头孢他啶和头孢哌酮影响大肠埃希菌生物膜形成的机制初探 3.1 CAZ和CFP调控Ecoli生物膜形成的作用与细菌耐药和耐药基因的相关性 经卡方检验，CAZ和CFP对细菌生物膜形成的调节作用在耐药表型不同的菌株之间无显著差异，提示药物影响生物膜形成的作用与细菌耐药表型无相关性。且可被CAZ抑制的ATCC700926和E46，携带ESBLs基因不同;携带相同耐药基因E49和E42，其生物膜形成受药物的影响却不相同。提示CAZ与CFP对Ecoli生物膜形成的调节，不受菌株是否携带ESBLs耐药基因影响。 3.2CAZ和CFP影响生物膜形成过程中的稳定性研究 1/4MIC(64μg/ml) CAZ加入含E46菌液的培养基中，药物即开始发生降解，随着培养时间延长，细菌浓度增加，CAZ降解速度加快，6h后药物浓度仅为初始浓度的39.3％。1/4 MIC CFP(64μg/ml)在含E11菌液的培养基中亦快速降解，2h即完全降解。 3.3亚-MIC CAZ和CFP对Ecoli生物膜形成主要调节基因的影响 3.3.1亚-MIC CAZ和CFP对Ecoli QS相关基因转录的影响 1/4 MIC CAZ和CFP与细菌共孵3h后，luxS/AI-2 QS系统信号分子合成酶LuxS的基因转录水平与生物膜变化一致，而另外两个QS相关基因pfs和tnaA未发生显著变化，结果提示luxS/AI-2群体感应系统可能在亚MIC CAZ和CFP调控Ecoli生物膜形成的过程中发挥重要作用。 3.3.2亚-MIC CAZ和CFP对Ecoli生物膜相关基因转录的影响 1/4 MIC CAZ和CFP与细菌共孵3h后，hha、tomb和ariR转录未发生显著变化，提示上述生物膜相关基因未参与CAZ和CFP对生物膜形成的影响。 第四部分 亚-MIC头孢他啶和头孢哌酮通过luxS/AI-2群体感应系统调节大肠埃希菌生物膜形成的机制研究 4.1亚-MIC CAZ和CFP对Ecoli luxS/AI-2系统的影响 4.1.1亚-MIC CAZ和CFP对Ecoli生长的影响 4.1.2亚-MIC CAZ和CFP对Ecoil luxS转录、AI-2合成及下游信号分子转录的影响 4.2针对luxS的反义寡核苷酸(as-ODNs)对CAZ和CFP调节生物膜形成作用的影响 针对luxS的反义寡核苷酸as-ODN4可降低4个菌株AI-2浓度达50％以上，提示其具有较好的luxS干扰效果。以as-ODN4转染Ecoli细胞，细菌生物膜形成能力显著下降，且转染后1/4 MIC CAZ和CFP不再引起细菌生物膜形成的改变，进一步证实亚-MIC CAZ和CFP对Ecoli生物膜的调节作用是基于luxS/AI-2系统的调控实现的。 结论： 1.亚-MIC CAZ和CFP可影响Ecoli生物膜的形成。 2.Ecoli临床分离株E42的生物膜形成在被亚-MIC CAZ抑制的同时，可被亚-MICCAZ诱导。 3.亚-MIC CAZ和CFP对luxS/AI-2系统活性的影响不是通过抑制或诱导细菌生长实现的，其对Ecoli生物膜的影响与其抗菌作用机制不同。 4.亚-MIC CAZ和CFP主要通过影响luxS的转录调控Ecoli生物膜形成，而不影响pfs、 tnaA、hha、tomb和ariR的转录。 5.亚-MIC CAZ和CFP对Ecoli生物膜的调控作用是基于群体感应系统luxS/AI-2活性变化实现的。
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