摘要
目前，国内外常用的血管介入栓塞止血剂主要有微弹簧圈、明胶海绵等固体材料以及氰基丙烯酸盐粘合剂、Onyx等液体材料。微弹簧圈为永久性栓塞剂，制作材料为铜、钨、铂等贵金属，种类繁多，制造工艺复杂且价格昂贵，使用时需根据靶血管管径选择相应型号。此外，微弹簧圈作为栓塞材料还存在栓塞不完全、血栓形成率低等不足，且永久性栓塞可导致脏器功能组织体积萎缩或引起慢性炎症甚至是器官损伤。明胶海绵是一种由多种氨基酸组成的动物蛋白，能被人体组织吸收，具有使用方便、价格低廉等优点，最先被应用于外科手术的术中止血。在介入领域，明胶海绵颗粒是目前唯一获批用于体内的生物可降解栓塞材料，主要用于破损血管的临时止血或肿瘤切除术前的临时血流阻断。明胶海绵颗粒在体内的降解吸收受诸多因素的影响，降解时间可从数日到数月不等，可在完全止血前即被机体吸收，使受损动脉发生再出血的几率增加。 因此，针对脾脏等腹腔实质脏器损伤出血的微创介入治疗目前尚无十分理想的栓塞材料。 采用海藻酸钠等天然高分子生物材料装载具有治疗作用的药物以制备载药微球栓塞剂，是近年来介入栓塞材料研究的热点之一。其中以海藻酸钠为原料制备的微球栓塞剂可装载和靶向释放药物，具有安全无毒、降解可控、普适性强、方便易用的优点，目前已被广泛应用于医药研究领域。高效止血药物凝血酶是一种针对外伤出血或消化道出血的常用止血剂，可促进血液中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，迅速形成血栓，适用于不同出血部位，特别是用于不规则伤口或创面的快速止血。但在凝血酶作用下由血液成分所形成的自体血栓质地软、强度差，易脱落或过早自溶，止血效果不稳定。根据上述情况，本课题拟将天然高分子生物材料海藻酸钠与高效止血药物凝血酶结合，制备新型复合微球介入栓塞止血剂，并对其物理学、药剂学和生物学特性进行研究，之后通过脾脏损伤出血动物模型，探索该新型栓塞材料的最佳使用方式并考察评估其栓塞止血效果。通过本课题，拟为脾脏等腹腔实质器官损伤出血的介入治疗提供高效、安全、普适、便捷且具有良好生物相容性的新型栓塞材料。 主要研究内容和结果如下: 1、凝血酶-海藻酸钙复合微球介入栓塞止血剂的研制 根据海藻酸钠的理化性质，以及蛋白质活性药物凝血酶的药理特性，选择反应条件温和的静电液滴法成功制备出凝血酶-海藻酸钙复合微球。在本研究中，制备凝血酶-海藻酸钙复合载药微球的原料液为由生理盐水(NS)配制的10mg/ml凝血酶-3％w/v海藻酸钠混合溶液，凝胶浴溶液为30g/L CaCl2、5g/L NaCl、1g/L NaH2P04和5g/L吐温-20组成的混合液。在高压静电成球装置(YD-06)的静电场力和自身重力作用下，原料液形成的细小液滴克服针尖粘附力和液体表面张力，快速滴入凝胶浴溶液中，通过海藻酸分子结构中的羧基与凝胶浴溶液中的Ca2+发生聚电解质反应，快速形成载有凝血酶的海藻酸钙微球。最终通过设置不同的设备参数，制备出了350μm和600μm两种粒径的载药微球产品。试制实验研究结果表明，载药微球的粒径与静电场电压呈正相关，与针孔直径、针头与凝固液面距离、原料液流呈速负相关。光镜和扫描电镜结果显示，所制备的凝血酶-海藻酸钙微球粒径均匀，凝血酶在球体内部和表面散在分布，微球结构疏松，表面粗糙并有大量微孔。上述结构特征将有利于微球与血液接触后快速释放表层凝血酶，同时粗糙多孔的微球表面将有利于网罗血液中的血小板和红细胞，激活凝血，快速形成含有微球的坚实血栓。 2、凝血酶-海藻酸钙复合微球介入栓塞止血剂的药剂学和物理学特性研究 (1)载药量与包封率 将所制备的凝血酶-海藻酸钙复合微球溶解于EDTA，利用紫外分光光度法检测溶液中凝血酶的浓度，并计算出微球的包封率（entrapment efficiency，EE）和载药量(drugloading，DL)。结果显示，350μm微球的EE和DL分别为72.4±8.6％和20±4.1mg/ml，600μm微球的EE和DL分别为70.5±6.1％和13±5.2mg/ml。两种不同粒径载药微球的包封率均达70％以上且无显著差异(p＞0.05)。由于350μm微球的粒径更小，在相同单位体积内，微球所占据的有效体积大于后者600μm微球，因此350μm微球的载药量高于600μm微球(p＜0.05)。 (2)释药模式与凝血酶活性残余 以NS作为释药介质，将定量微球投入其中并置于100rpm摇床上，环境温度4℃。按预设的多个时间点取样，再利用紫外分光光度法检测各样品溶液中的凝血酶浓度，绘制释药曲线并对载药微球的释药模式进行拟合。结果显示，0h-2h期间350μm微球中的凝血酶为快速释药相，累计释药率为34.4±4.9％，此后为缓慢释放相，192h的平均累计释药百分比可达90.23％;600μm微球则以缓释为主，192h的平均累计释药率为67.07％。350μm载药微球具有突释和缓释两种释药模式，其累积释药率也明显高于600μm载药微球。突释效应对于微球与血液成分接触后快速形成的混合血栓具有重要作用，缓释则能够持续保持靶点部位所需的药物浓度。因此，350μm凝血酶-海藻酸钙微球更加符合应用需求。 本部分药剂学实验结果表明，采用静电液滴法制备凝血酶-海藻酸钙微球具有药物利用率高、释药模式理想、药物活性好等特性，有望实现在体外与血液快速形成微球混合血栓和血管内栓塞后不断释药以加固血栓的既定目标。物理学特性测试结果提示，凝血酶-海藻酸钙微球作为一种新型材料，与血液混合所形成的混合血栓在强度和抗挤压能力等方面均显著强于柔软易碎的单纯血栓。因此，凝血酶-海藻酸钙微球的药剂学特性以及微球所参与形成混合血栓的物理学性质均能满足有效栓塞受损靶血管的应用需求。 3、凝血酶-海藻酸钙复合微球介入栓塞止血剂的生物相容性研究 (1)体外细胞毒性实验 根据材料细胞毒性检测的要求并结合凝血酶-海藻酸钙微球材料的临床应用特点，选择了小鼠成纤维细胞(L929)、人动脉血管内皮细胞(VECs)和人外周血红细胞(RBC)进行了间接接触（浸提液）和直接接触两种方式的细胞毒性检测实验。L929细胞毒性实验结果表明，凝血酶-海藻酸钙微球为细胞毒性Ⅰ级（低细胞毒性）。 凝血酶-海藻酸钙微球作为一种栓塞止血材料，实际应用时将与人动脉血管内皮细胞、红细胞等直接发生接触。VECs直接接触毒性实验结果显示，凝血酶-海藻酸钙微球与VECs共培养后，细胞存活率与正常培养基对照组无明显差异，表明无VECs细胞毒性;RBC溶血实验结果表明，凝血酶-海藻酸钙微球不引起外周血RBC发生溶血。 上述结果证实，凝血酶-海藻酸钙微球作为一种血管内应用的新型栓塞材料，具有良好的细胞相容性和血液相容性。 (2)动物在体实验 对于新型医用材料的最终临床前评估，主要是基于动物实验。为此，我们利用C57BL/6J小鼠、SD大鼠、新西兰兔等多种动物模型，分别从潜在刺激性、全身急性毒性、遗传毒性、组织炎症反应以及体内降解速率等方面对凝血酶-海藻酸钙微球的组织相容性进行了实验评估。 新西兰大白兔的背部皮肤具有高度敏感性，是皮内注射刺激试验的理想动物模型。在本研究中，将含高浓度凝血酶-海藻酸钙微球溶出物的浸提液1ml分别注射到4只雄性新西兰大白兔背部皮内后，在72h的观察期内未见局部皮肤发生任何红斑、红疹、水疱或水肿等异常反应，刺激评分为0分，与NS对照组无差异。因此，凝血酶-海藻酸钙微球对机体组织无潜在刺激性和毒性。 将40只雄性C57小鼠随机分为实验组和对照组（每组各20只），实验组于腹腔内注入高浓度凝血酶-海藻酸钙微球浸提液1ml，对照组则用NS代替，以观察微球溶出物是否引起的全身急性毒性反应。为期28d的观察结果显示，实验组和NS对照组动物的一般情况均正常，未发现死亡或异常行为活动，两组动物腹腔注射后的体重增长量无差异;组织学检查结果示实验组动物的心脏、肝脏、脾脏、肺及肾脏等主要脏器无明显病理改变。凝血酶-海藻酸钙微球的遗传毒性检测采用的是骨髓微核实验。将15只雄性C57小鼠随机分为凝血酶-海藻酸钙微球浸提液实验组，环磷酰胺注射液阳性对照组和NS阴性对照组，分别按照50ml/kg，40mg/kg和50ml/kg的剂量行腹腔内注射，24h后取股骨骨髓涂片并行组织学检查。实验结果显示，经腹腔注射浸提液后，C57小鼠骨髓中的微核形成率与阴性对照(NS)无统计学差异，而环磷酰胺注射液阳性对照组的微核形成率明显高于实验组和阴性对照组。因此，凝血酶-海藻酸钙微球既不引起全身急性毒性反应，又无导致机体细胞DNA断裂和非整倍体化的遗传毒性。 综上所述，本部分体外细胞毒性实验和动物在体实验结果证实，凝血酶-海藻酸钙载药微球是一种具有良好的细胞相容性、血液相容性和组织相容性的可降解材料，符合对栓塞材料的生物安全性要求。 综上所述，本课题针对腹腔实质脏器闭合性损伤尚无理想栓塞材料的现状，成功探索了新型天然高分子生物复合栓塞止血材料凝血酶-海藻酸钙微球的制备技术方法，并对其药剂学和物理学特性，生物相容性，以及临床适用性进行了全面研究。实验结果初步证实了该新型材料具有栓塞止血迅速、效果可靠、普适性强、使用方便、生物相容性好等特征，适用于脾脏、肾脏等腹腔实质脏器闭合性损伤的介入止血治疗。该新型栓塞材料的研发和应用将有助于进一步提高实质脏器损伤出血的介入救治效果，改善预后，同时也为天然生物高分子材料的医学应用转化提供了新的研究方向和思路。
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