摘要
背景与目的： 乳头瘤病毒（human papilloma virus）为乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是一类特异感染人皮肤、粘膜的无包膜的小型双链环状DNA病毒，其分子量大约为8000bp。目前已分离出130多种，而其中约40型能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖，大多表现为寻常疣、尖锐湿疣等症状。随着尖锐湿疣、宫颈癌、肛门癌等发病率的逐年上升，人们对人乳头瘤病毒的关注度也越来越高。根据对组织的致癌性不同可分为低危型及高危型，高危型中HPV16、18型引起的宫颈癌最为常见，有研究资料显示，宫颈癌组织中约93％可检测到HPV DNA，其中HPV16型占65％[1]。HPVE6、E7是致癌关键蛋白。HPV16E6是HPV感染过程中表达最早的蛋白之一，E6蛋白为一种多功能蛋白，其中E6可导致P53降解失活，使细胞周期失控[8];可作用于端粒酶、并激活，使正常细胞达到永生化[3];E6与含PDZ结构域的蛋白靶向结合，使得正常细胞发生癌变E6还可使促凋亡蛋白因子Bak的表达下调，增加染色体不稳定性，抗肿瘤细胞凋亡，可抑制TGF-R2的诱导和表达[4]。大量的来自动物及人体不同形式的HPV E6疫苗的研究证明E6蛋白具有免疫原性，其中含有许多病毒特异性CTL抗原表位[5]。由此产生的特异性CTL在消灭病毒感染细胞及相关肿瘤细胞的免疫反应中起重要作用，因此，利用E6作为靶抗原进行疫苗研究具有重要意义[6]。本实验在于了解大连地区宫颈癌患者HPV16型E6蛋白的结构特点，为临床诊断、治疗HPV16感染引起的疾病宫颈癌提供理论依据，为HPV致病性和抗原性的研究，以及为宫颈癌疫苗的研发提供参考。 方法： 1. 通过常规方法提取组织DNA，分离出HPV16型DNA片段; 2. 在有引物的参与中应用PCR技术扩增HPV16型E6基因片段; 3. 目的基因片段（HPV16型E6蛋白）与pGM-T载体连接并转化至DH5α感受态细胞; 4. 抽提质粒DNA，EcoRⅠ酶切鉴定质粒DNA，阳性克隆质粒送测序; 5. 以GenBank收录的日本HPV标准株E6序列为参考序列，用Blast及多序列比对软件Clustal X2.1等对核苷酸序列和对应的氨基酸序列分析。 结果： 1. 以宫颈癌组织标本（宫颈癌组织存于病理蜡块）中提取的DNA作为模板，PCR扩增，得到约为520bP的基因片段; 2. 与pGM-T连接，构建HPV16型E6克隆质粒pGM-T-E6; 3. EcoRI酶切鉴定质粒DNA正确; 4. 克隆质粒测序发现六个样本均与日本HPV标准株E6序列（GenBank中序列编号分别为KJ543728.1及AB889490.1）高度同源，有3个患者HPVE6基因片段发生变异，变异位点为28(A-C)、54(G-T)、92(T-C)、138(T-G)。 结论： 1. 成功克隆了HPV16型E6基因片段; 2. 成功构建了HPVI6型E6蛋白原核表达系统; 3. 大连市宫颈癌患者HPV16型E6基因与日本HPV标准株E6序列高度同源，并有部分碱基位点发生变异，为临床诊断、治疗HPV16感染引起宫颈癌提供理论依据，为HPV致病性和抗原性的研究，以及为宫颈癌疫苗的研发提供参考。
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