摘要
甲状腺癌是内分泌系统和头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤。维甲酸是维生素A的中间代谢产物。维生素A(视黄醇，retinol)进入细胞后，经过氧化反应转化为视黄醛，视黄醛被氧化变成维甲酸。维甲酸存在不同亚型，包括全反式维甲酸(RA)，9-顺式维甲酸(9-cis RA)和13-顺式维甲酸(13-cis RA)等，其中RA是临床上已经使用的促分化治疗的抗肿瘤药物。 目的:本文以未分化甲状腺癌KAT-18细胞系及PDTC或ATC组织为研究对象，以对RA相对敏感的髓母细胞瘤细胞系MED3细胞作为对照;观察RA在未分化甲状腺癌中的敏感性以及PDTC或ATC组织中维甲酸胞内结合蛋白的表达情况;并利用分子生物学检测方法分析维甲酸信号通路组分的表达与其敏感性的关系;应用去甲基化药物DAC联合RA，观察在改变肿瘤细胞的表观遗传修饰后，是否可以改变肿瘤维甲酸信号通路状态及RA信号的敏感性，进一步探讨肿瘤细胞RA信号的分子机制。 方法:髓母细胞瘤细胞系Med-3为一名10岁男性髓母细胞瘤患者的手术切除标本，由日本神户大学神经外科建立提供。29例PDTC或ATC组织标本由大连医科大学附属第一医院病理科及中国医科大学病理科提供。取20例瘤旁组织作为正常对照。 本研究采用组织微阵列、细胞培养、HE染色、Hoechst活细胞染色、免疫组织化学(IHC)、免疫细胞化学(ICC)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western-blotting)等方法，开展了以下内容:1）采用了HE染色，MTT检测和Hoechst活细胞染色等技术观察人未分化甲状腺癌细胞系KAT-18与人髓母细胞瘤细胞系Med-3的维甲酸敏感性;2）观察维甲酸信号通路组分:维甲酸胞内载体CRABP-Ⅱ和FABP5，核内受体RARα，PPARβ/δ等在人未分化甲状腺癌KAT-18细胞系的表达情况，以及RA对各组分转录水平的影响;3）采用蛋白免疫印迹和免疫细胞化学检测KAT-18细胞中维甲酸胞内结合蛋白CRABP-Ⅱ、FABP5，核受体RARα和PPARβ/δ等的表达情况;4）镜下观察、HE染色和MTT检测等筛选去甲基化剂DAC的合理用药浓度;5）通过HE染色，MTT检测和Hoechst活细胞染色技术检测联合用药后，观察KAT-18细胞系RA敏感性的变化;6）逆转录聚合酶链式反应检测胞内结合蛋白CRABP-Ⅱ、FABP5和核受体RARα、PPARβ/δ等表达情况;7）通过人甲状腺癌组织微阵列结合免疫组织化学技术检测CRABP-Ⅱ和FABP5表达情况。实验数据采用Prism5.0(GraphPadSoftware，Inc.，La Jolla，CA)统计软件进行统计分析。 结果: 1、低分化、未分化甲状腺癌组织中维甲酸信号通路状态的研究 在本组29例人低分化、未分化甲状腺癌组织微阵列中，所有标本失去正常的结构，呈低分化或未分化表现。 1.1 维甲酸信号通路关键组分FABP5、CRABP-Ⅱ的表达依据相对表达情况分为四种类型:FABP5(++)/CRABP-Ⅱ(+/-)表达类型;FABP5(+)/CRABP-Ⅱ(+)均衡表达类型;CRABP-Ⅱ(-)/FABP5(-)表达类型;CRABP-Ⅱ(+)/FABP5(-)表达类型。 1.2 低分化或未分化甲状腺癌组织中FABP5/CRABP-Ⅱ的表达比率类型 在本组病例中，FABP5(++)/CRAB P-Ⅱ(+/-)表达比率类型37.9％(11/29);FABP5(+)/CRABP-Ⅱ(+)均衡表达类型41.4％(12/29); FABP5(-)/CRABP-Ⅱ(-)均阴性表达类型6.9％(2/29); CRABP-Ⅱ(+)/FABP5(-)表达类型13.8％(4/29)。在本组PDTC或ATC标本中，FABP5的表达阳性率为79.3％，明显高于癌旁正常甲状腺组织中的阳性率40.0％; CRABP-Ⅱ表达的阳性率为65.5％，明显高于癌旁正常甲状腺组织中的阳性率25.0％。CRABP-Ⅱ和FABP5在PDTC或ATC中的表达相关性无统计学意义。 2、未分化甲状腺癌细胞系维甲酸敏感性与维甲酸信号通路状态关系的研究 2.1 维甲酸处理后未分化甲状腺癌KAT-18细胞的形态学观察 HE染色结果显示:在10μMRA，48h处理条件下，KAT-18细胞形态及细胞数未见明显差异，提示KAT-18细胞对RA不敏感。 2.2 MTT实验结果及维甲酸信号通路成员mRNA水平表达情况 KAT-18细胞分别在1、5、10μM RA，48h处理条件下，MTT分析未见明显差异，提示KAT-18细胞对RA不敏感，与HE染色结果相符合。 在10μM RA，48h处理条件下，KAT-18细胞的CRABP-Ⅱ、FABP5、RARα和PPARDβ/δ的mRNA表达情况:FABP5表达强于CRABP-Ⅱ表达;RA处理前后各组分的mRNA水平表达几乎没有变化。 KAT-18细胞与MED-3细胞在10μM RA，48h处理条件下，KAT-18细胞RA处理组与对照组MTT分析未见差异;对RA不敏感KAT-18细胞呈FABP5(++)/CRABP-Ⅱ（+/-）表达类型。MED-3细胞RA处理组与对照组MTT分析差异有显著性（*，P＜0.05）;对RA敏感的MED-3细胞呈CRABP-Ⅱ(+)/FABP5(-)表达类型。 2.3 维甲酸信号通路组分蛋白水平表达情况 在10μM RA，48h处理条件下，ICC检测维甲酸通路组分表达情况:KAT-18细胞的FABP5表达几乎没有变化;但RA处理后CRABP-Ⅱ表达略有增强。 Western-blotting检测KAT-18细胞的CRABP-Ⅱ、FABP5、RARα和PPAβ/δ蛋白表达情况:RA处理前后维甲酸信号通路组分CRABP-Ⅱ和FABP5的表达情况与ICC检测结果大致相同;RARα、PPARβ/δ表达几乎没有变化。 2.4 甲状腺癌分化标志物表达情况 在10μM RA，48h处理条件下，KAT-18细胞中，对照组与RA处理组均可见NIS微弱表达;对照组可见Tg微弱表达，RA处理组Tg表达似乎略增强;正常甲状腺组织中可见Tg与NIS强表达。 3、地西他滨联合维甲酸对未分化甲状腺癌细胞系维甲酸敏感性的影响及其与维甲酸信号通路状态关系的研究 3.1 DAC联合RA处理未分化甲状腺癌KAT-18细胞的形态学观察 HE染色结果:在25μM DAC，72h处理条件下，KAT-18细胞形态轻微增大，细胞明显减少;但在10μM RA，48h或10μM DAC，72h+10μM RA，48h处理条件下，KAT-18细胞形态及细胞数未见明显差异。 3.2 Hoechst活细胞染色结果 Hoechst活细胞染色:在DAC或DAC联合RA处理KAT-18细胞后，KAT-18细胞分别在10μM RA，48h;5，10，25μM DAC，72h;5，10，25μM DCA，72h+10μMRA，48h处理条件下，DAC联合RA组的每个视野细胞数略多于同剂量DAC组;DAC组(5，10，25μM，72h)的细胞数少于对照组(与对照组比较，*，P＜0.05)。 3.3 维甲酸信号通路组分mRNA水平表达情况 RT-PCR结果:KAT-18细胞在5，10μM DAC，72h或DAC联合RA(10μM DAC，72h+10μM RA，48h)或10μM RA，48h处理条件下，对照组和RA组的CRABP-Ⅱ、FABP5在mRNA水平表达几乎无变化;这提示DAC或DAC联合RA处理没有改变KAT-18细胞的FABP5/CRABP-Ⅱ的表达比率。与FABP5表达比较，KAT-18细胞CRABP-Ⅱ的表达相对较低。 结论: 1.在本组PDTC或ATC标本中，FABP5的表达阳性率为79.3％，明显高于正常甲状腺组织中的阳性率40.0％; CRABP-Ⅱ表达的阳性率为65.5％，明显高于正常甲状腺组织中的阳性率25.0％。但CRABP-Ⅱ和FABP5在PDTC或ATC中表达相关性无统计学意义。 2.未分化甲状腺癌细胞系KAT-18对RA不敏感。未分化甲状腺癌细胞系KAT-18的维甲酸信号通路中，维甲酸载体呈FABP5(++)/CRABP-Ⅱ(+/-)表达类型。 3.RA没有改变未分化甲状腺癌细胞系KAT-18维甲酸信号通路组分的表达及表达类型。RA也没有改变未分化甲状腺癌细胞系KAT-18的Tg、 NIS低或未表达状态。 4.去甲基化药物DAC可以抑制未分化甲状腺癌细胞KAT-18的生长。DAC或DAC联合RA不能改变未分化甲状腺癌细胞系KAT-18对RA敏感性;也不能改变未分化甲状腺癌细胞系KAT-18的维甲酸信号通路中的关键组分FABP5/CRABP-Ⅱ的表达比率。 5.DAC联合RA序贯处理未分化甲状腺癌细胞系KAT-18时，联合RA组的效果不及同剂量的DAC组，提示在DAC联合应用RA处理未分化甲状腺癌策略中，RA可能具有促进KAT-18细胞生长的作用。因此，在甲状腺癌的治疗策略中，如果涉及RA时，应该考虑到维甲酸RA-FABP5-PPARβ/δ增殖信号通路情况。
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