摘要
非酒精性脂肪性肝病的发病机制中一个重要的影响因素是脂质代谢异常造成的肝细胞凋亡。有研究表明，miR-34a的上调与肝细胞凋亡有密切的关系。鼠尾草酸(camosic acid，CA)是一种多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎及抗凋亡等作用。已有文献证实多酚类化合物能通过作用于miRNAs，从而靶向下游因子发挥作用。SIRT1作为miR-34a的下游作用因子，其在非酒精性脂肪性肝病中发挥重要的作用。而且，SIRT1/p66shc信号通路的活化能够减轻肝缺血再灌注造成的肝细胞凋亡。但鼠尾草酸是否能够通过下调miR-34a，靶向SIRT1/p66shc信号通路，在大鼠非酒精性脂肪性肝病中发挥保护作用目前未见报道。 目的: 本试验旨在研究鼠尾草酸对大鼠非酒精性脂肪性肝病的保护作用。探索鼠尾草酸抗肝细胞凋亡作用与miR-34a相关通路之间的关系。 方法: 1、鼠尾草酸对大鼠非酒精性脂肪性肝病的保护作用研究 将50只健康成年的雄性SD大鼠随机分为以下5组:1）正常饮食组(ND);2)鼠尾草酸正常给药组(60mg/kg/d);3)高脂饮食组(HFD);4)高脂饮食+低剂量鼠尾草酸组(30mg/kg/d);5)高脂饮食+高剂量鼠尾草酸组（60mg/kg/d）。10周末，大鼠被麻醉后腹主动脉取血留样并分离肝脏组织。检测大鼠血清中谷丙转氨酶(Alanine Aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(Aspartate Aminotransferase，AST)、甘油三脂(serum triglyceride，TG)、胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)的水平及肝组织中丙二醛(malondialdehyde，MDA)、superoxide dismutase(SOD)的活性。光镜下观察各组动物肝脏组织病理切片的形态学结构变化。 qRT-PCR检测肝组织miR-34a的表达;Western Blot法检测肝组织SIRT1、p66shc、B-cell lymphoma-extra large(Bcl-xL)、Cleaved caspase-3、manganese superoxide dismutase(MnSOD)蛋白表达水平。TUNEL法及caspase-3/9活性测定肝脏组织肝细胞的凋亡情况。 2、鼠尾草酸对棕榈酸(palmitic acid，PA)诱导的细胞的保护作用及相关机制研究 (1)鼠尾草酸对PA诱导的L02细胞的凋亡的保护作用 L02细胞随机分为五组:空白对照组;PA组;PA+antago-miR-control组;PA+antago-miR-34a组;PA+CA(10μM)。PA孵育24 h后，分别按照组别进行处理，antago-miR-34a或药物处理12h后，采用TUNEL法检测肝脏细胞的凋亡情况。qRT-PCR法检测细胞内miR-34a表达水平。Western Blot法检测SIRT1、p66shc蛋白表达水平。 (2)鼠尾草酸对miR-34a表达的抑制及对SIRT1/p66shc信号通路的激活作用 L02细胞随机分为三组:空白对照组;胆酸处理组(10μM);鼠尾草酸处理组(10μM)。药物与细胞共同孵育12h后，qRT-PCR法检测细胞内miR-34a表达水平，Western Blot法检测SIRT1、p66shc蛋白表达水平。 L02细胞随机分为四组:空白对照组;鼠尾草酸处理组;ago-miR-34a;ago-miR-34a+鼠尾草酸处理组。ago-miR-34a作用24 h后，药物处理或不处理，提取RNA或蛋白，qRT-PCR法检测细胞内miR-34a表达水平，Western Blot法检测SIRT1、p66shc蛋白表达水平。 (3)鼠尾草酸通过抑制miR-34a对SIRT1的调节作用 L02细胞随机分为八组:wt-Luc-SIRT1+ago-miR-control;wt-Luc-SIRT1+ago-miR-control+CA;wt-Luc-SIRT1+ago-miR-34a;wt-Luc-SIRT1+ago-miR-34a+CA; mut-Luc-SIRT1+ago-miR-control;mut-Luc-SIRT1+ago-miR-control+CA; mut-Luc-SIRT1+ago-miR-34a;mut-Luc-SIRT1+ago-miR-34a+CA。转染后，鼠尾草酸给药作用12h后进行双荧光素酶报告基因荧光强度的检测。 结果: 实验结果显示:高脂饮食会引起大鼠ALT、AST、TG、TC、LDL-C的水平上升及HDL-C、SOD的水平下降，同时使大鼠肝组织中的MDA含量明显上调。而鼠尾草酸处理能明显改善这些情况。且鼠尾草酸的处理可上调MnSOD及Bcl-xL蛋白表达，降低Cleaved caspase-3蛋白表达。鼠尾草酸能够减轻高脂饮食或棕榈酸造成的caspase-3和caspase-9活性的升高。机制上，鼠尾草酸显著下调了miR-34a的表达且能激活SIRT1/p66shc抗凋亡的信号通路。细胞实验中，双荧光素酶报告基因表明鼠尾草酸对SIRT1的调控至少是通过miR-34a实现的，而且鼠尾草酸能够抵抗miR-34a过表达所引起的SIRT1/p66shc通路的抑制及肝细胞的凋亡。以上结果表明鼠尾草酸对大鼠非酒精性脂肪性肝病具有保护作用，并且这种作用是通过下调miR-34a，激活SIRT1/p66shc抗凋亡通路实现的。 结论: miR-34a/SIRT1-p66shc信号通路在大鼠非酒精性脂肪性肝病中起关键性作用;鼠尾草酸可通过下调miR-34a的表达，激活SIRT1/p66shc抗凋亡信号通路从而发挥抗非酒精性脂肪性肝病的保护作用。
NETL