摘要
本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分口腔鳞状细胞癌的基因表达谱芯片检测 目的:本实验通过基因表达谱芯片检测口腔鳞状细胞癌组织与癌旁正常对照组织的基因表达谱，从基因表达谱结果中筛选出变化明显的差异基因。 方法:在广东省口腔医院收集口腔鳞状细胞癌患者两例，每例患者采集口腔鳞状细胞癌组织和癌旁正常对照组织作为一组，采用Roche NimbleGen全基因组表达谱芯片进行口腔鳞状细胞癌及癌旁正常对照组织的基因表达谱检测。 结果:按差异基因筛选标准，从32448条检测基因中筛选出口腔鳞状细胞癌肿瘤组织的差异基因共有7872条，占筛选基因总数的24％;其中上调表达的基因有3800条，下调表达的有4072条。 结论:通过基因表达谱芯片检测并根据表达差异一倍以上的筛选标准得到了7872个表达差异的基因。由此可见肿瘤的发生发展不是单个或几个基因的作用结果，以往实验往往针对某个或某几个基因的研究有很大的局限性。同时也说明了肿瘤的产生是多基因成网络相互调节作用的结果，而且这个网络的作用关系是非常复杂的。 第二部分基因表达谱芯片数据的生物信息学分析 目的:我们通过基因表达谱芯片检测比较了口腔鳞状细胞癌组织和癌旁正常对照组织的基因表达谱差异，为了把这些基因表达谱的数据和生物学功能联系起来，我们就要对数据进行聚类分析。此部分实验通过对基因表达谱芯片的检测结果进行生物信息学分析，找出筛选的差异基因的变化趋势及相互作用网络。 方法:通过基因表达谱芯片配套软件Agilent GeneSpring GX v12.0分析第一部分基因表达谱芯片实验数据，进行GO分析和KEGG生物学通路富集分析，找出差异基因的变化趋势及相互之间的可能作用关系。 结果:使用基因表达谱芯片配套软件Agilent GeneSpring GX v12.0进行差异基因功能分类注释(Gene ontology，GO)分析和基因表达谱芯片数据的KEGG生物学通路富集分析，将基因分为上调基因和下调基因分别进行功能富集分析。 第一 GO分析口腔鳞状细胞癌组织与癌旁正常对照组织样本RNA间的差异基因分布情况如下: 1.生物过程部分 1.1 上调基因中生物过程部分:上调差异基因功能富集分析发现共有532个生物过程的亚层，差异表达的基因主要富集于刺激反应(response to stimulus)(6.75)，免疫系统过程（immune system process）(6.06)，细胞外基质组织(extracellular matrix organization)(5.54)，免疫系统过程的调节(regulation ofimmune system process)(5.49)，免疫反应(immune response)(5.39)，器官形态(organ morphogenesis)(4.88)，细胞外结构组织(extracellular structureorganization)(4.84)，淋巴细胞副刺激(lymphocyte costimulation)(4.77)，T细胞副刺激(T cell costimulation)(4.77)，细胞活化的正调节(positive regulationof cell activation)(4.75)。 1.2 下调基因中生物过程部分:下调差异基因功能富集分析发现共有715个生物过程的亚层，差异表达的基因其中主要集中于:信号(signaling)(9.70),生物调节(biological regulation)(9.29)，死亡(death)(9.12)，细胞死亡(cell death)(8.98),细胞过程(cellular process)(8.89)，信号传导(signal transduction)(8.74)，细胞组成活动(cellular component movement)(8.69)，创伤反应(response to wounding)(8.24),生物质量调节(regulation of biological quality)(8.11)，创伤愈合(woundhealing)(7.90)。 2.细胞组分(Cellular Component) 2.1 上调基因中细胞组分部分:上调差异基因功能富集分析发现共有41个细胞组分的亚层，差异表达的基因其中主要集中于细胞外区域部分(extracellularregion part)(12.14)，细胞外区域(extracellular region)(12.14)，细胞外空间(extracellular space)(10.91)，质膜部分(plasma membrane part)(7.69)，质膜必需的(integral to plasma membrane)(7.50)，质膜固有的(intrinsic to plasmamembrane)(7.49)，细胞外基质(extracellular matrix)(6.00)，纤维胶原蛋白(fibrillarcollagen)(5.53)，质膜(plasma membrane)(5.02)，细胞周围(cell periphery)(4.93)。 2.2 下调基因中细胞组分部分:下调差异基因功能富集分析发现共有149个细胞组分的亚层，差异表达的基因其中主要集中于:细胞质(cytoplasm)(18.17),细胞质部分(cytoplasmic part)(11.18)，细胞内部分(intracellular part)(9.07),质膜(plasma membrane part)(9.01)，细胞内（intracellular）(8.88)，细胞组成(cell fraction)(8.79)，胞液(cytosol)(8.77)，不溶组成(insoluble fraction)(8.65)，细胞膜组成(membrane fraction)(7.99)，细胞周围（cell periphery）(7.31)。 第二 基因表达谱芯片数据的KEGG生物学通路富集分析 根据最新KEGG数据库，我们进行基因表达差异数据的pathway分析。 结论:通过生物信息学分析我们发现口腔鳞状细胞癌差异基因富集于三大类共1666个亚类，主要集中于免疫、细胞结构及信号传导调节等生物过程方面，质膜、细胞膜、细胞质、胶原蛋白、细胞外区域等细胞组成方面和与蛋白、糖、酶、激酶、跨膜受体等结合的细胞功能方面。而这些方面的变化与肿瘤细胞的粘附、侵袭、转移等密切相关。由此可见肿瘤的发生发展不是单个或几个信号通路的作用结果，是多个信号通路呈网络相互调节作用的结果，这个网络的作用关系是非常复杂，是参与肿瘤发生的多信号通路的综合作用结果。 第三部分口腔鳞状细胞癌差异基因的荧光定量RT-PCR表达验证 目的:本实验部分通过第一部分基因表达谱芯片数据与实验组前期蛋白组学实验构建的口腔鳞状细胞癌52种差异蛋白作用网络共同分析，筛选出表达变化趋势相同且差异相对较大的基因，通过荧光定量RT-PCR实验去验证这些差异基因在口腔鳞状细胞癌组织和癌旁对照组织中的表达，从而确定差异基因的表达及基因表达谱芯片的可靠性，进而研究各差异基因之间的可能作用机制。 方法: 1.需要进行荧光定量RT-PCR验证的差异基因的确认方法:在前期课题组经典蛋白组学实验采用Bio-Rad双向电泳系统进行一向等电聚焦和二向垂直电泳筛选出的52种口腔鳞状细胞癌差异蛋白中，我们综合基因表达谱芯片检测结果，选择与52种差异蛋白对应基因变化一致且相对变化较大的基因。我们共选出15个目标基因，其中表达上调的基因有6个，分别为:GNB2L1、ARHGDIB、STMN1、LGALS7、EIF5A、TAGLN。表达下调的基因有9个，分别为:S100A7、S100A8、S100A9、ANXA1、ANXA2、ANXA5、CSTB、CRYAB、 SERPINB3。 2.在广东省口腔医院等多个医院收集口腔鳞状细胞癌患者32例，每例患者采集口腔鳞状细胞癌组织和癌旁正常对照组织作为一组，通过荧光定量RT-PCR进行较大样本的表达验证。 结果:经过荧光定量RT-PCR验证（GAPDH为内参）后，差异基因(GNB2L1、ARHGDIB、STMN1、LGALS7、EIF5A、TAGLN)表达上调，差异具有统计学意义(P＜0.001)。差异基因（S100A7、S100A8、S100A9、ANXA1、ANXA2、ANXA5、CSTB、CRYAB、SERPINB3）表达下调，差异具有统计学意义(P＜0.001)。荧光定量RT-PCR验证差异基因的变化趋势与基因表达谱芯片数据结果具有很好的一致性。 结论:荧光定量RT-PCR技术是验证基因表达谱芯片数据最精确的技术，本实验我们采用荧光定量RT-PCR技术对较大样本量进行验证，实验结果表明荧光定量RT-PCR验证结果与基因表达谱芯片结果一致。鉴于差异基因经荧光定量RT-PCR验证与芯片基因表达一致，认为Roche NimbleGen全基因组表达谱芯片结果的可信性较高。通过基因表达谱芯片的检测和荧光定量RT-PCR的验证实验我们发现口腔鳞状细胞癌组织具有很多的差异基因、蛋白，而不是一个或者几个基因发生改变，也指示我们要研究口腔鳞状细胞癌的发生发展机制，要把这些差异基因都考虑进去，放在一起进行研究。
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