摘要
目的： 本课题前期在hTERTC端截取编码第936-1132氨基酸的碱基序列片段，构建了真核和原核表达载体。该基因序列包括一个核仁定位信号序列（第965-981氨基酸）和与五个端粒DNA结合的氨基酸序列（第963-972、993-1002、1047-1056、1077-1086、1108-1117氨基酸）。由于表达的hTERTC末端包含197个氨基酸，我们把它命名为C197。前期的研究表明，C197能够抑制Hela细胞增殖。但表达量不高，不便于后续研究。为了便于体内试验和增强表达效果，本研究利用过表达载体重组腺病毒PAdEasy-1载体系统，构建了能高效表达C197片段的重组腺病毒Ad-GFP-C197，通过观察C197过表达在体内外对肿瘤细胞增殖的影响，并对其作用机制进行初步探讨，为进一步研究hTERT的C末端功能打下基础，同时也为肿瘤的生物治疗提供新的思路。 方法： 1.重组腺病毒Ad-GFP-C197构建与表达 1.1 C197基因片段的获取 根据GenBank公布的人hTERT基因序列，选取C端第936-1132氨基序列片段（命名为C197），在该片段中的C端引入EcorⅤ限制性酶切位点，在N端引入6个his标签和SalⅠ限制性酶切位点，片段总长度为650 bp，将其合成后克隆至pGSI载体保存。使用时经双酶切后经过回收纯化得到外源基因片段C197即可。 1.2 重组腺病毒Ad-GFP-C197的构建 将带有6个his标签C197的cDNA序列克隆至穿梭质粒PAdTrack-CMV得到重组质粒PAdTrack-CMV-C197，经PmeⅠ酶切线性化后转化进入到含有骨架质粒PAdEasy-1的BJ5183细菌中进行同源重组，得到重组大质粒PAd-GFP-C197并进行一系列鉴定，确定构建成功后，将其转染进入HEK293细胞中进行包装，得到重组腺病毒Ad-GFP-C197。对照腺病毒Ad-GFP按照同样的方法进行构建。 1.3 目的蛋白C197的表达 把重组腺病毒Ad-GFP-C197感染新的一批HEK293细胞，提取细胞RNA和细胞总蛋白后，用荧光定量PCR方法检测C197 mRNA的转录情况，用免疫印迹法检测鉴定目的蛋白C197表达情况。 1.4 重组腺病毒滴度测定 HEK293细胞铺于24孔板中，每孔5×105细胞。重组腺病毒用PBS稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-76个梯度。待细胞贴壁后，将稀释好的病毒每孔加入50 ul，每组实验共3个复孔。48 h观察并计算绿色荧光数。荧光数在20-50个最佳。按照公式:病毒滴度PFU/ml=[(一个视野的荧光数)*每个孔的视野数]/（加入的病毒体积*稀释倍数）计算病毒滴度即可。 1.5 C197蛋白的表达与纯化 按常规细胞培养方法对Hela细胞细胞进行复苏、传代等操作。将Hela细胞按照1×106铺板于100 mm2培养皿中（共15个皿），待细胞密度为80％时，进行实验干预（用重组腺病毒Ad-GFP-C197用冷的无菌PBS稀释后，以MOI=100感染各培养皿中Hela细胞）;待24 h后换液并在荧光显微镜下观察绿色荧光，于48 h收集细胞并提取总蛋白，利用金属(Ni2+)柱（镍柱）将带有his标签的C197蛋白挂住，用梯度咪唑溶液进行洗脱，回收洗脱液行SDS-PAGE后经考马斯亮蓝染色后观察25 KDa附近是否有条带即可。 1.6 重组腺病毒Ad-GFP-C197对Hela细胞增殖及细胞凋亡的影响 按常规细胞培养方法对Hela细胞进行复苏、传代等操作。 将Hela细胞按1×104个接种到96孔培养板中，Hela细胞接7块96孔板，共2个实验组(n=6)，待细胞贴壁后进行实验干预。实验干预后每隔24h取出一块96孔培养板，MTT法测量所有实验孔OD值，对照病毒组和重组腺病毒组各有6个单独样本并对其OD值进行统计学分析。 将Hela细胞按1×105个接种到24孔培养板中。接3块24孔板，共2个实验组（Ad-GFP-C197组和Ad-GFP组，n=3），待细胞贴壁后进行实验干预。实验干预后分别于24 h、48 h和72 h取出24孔培养板，按照AnnexinⅤ-PE凋亡试剂盒说明书处理样品后上流式细胞仪进行检测并收集数据，根据早期凋亡细胞占活细胞数的比例来计算凋亡率并进行统计; 以上均数据采用SPSS13.0统计软件，使用单因素方差分析的方法对数据进行统计分析，分析其是否具有显著性差异。 2.重组腺病毒Ad-GFP-C197的细胞内定位及对Hela细胞中端粒酶活性的影响 按常规细胞培养方法对Hela细胞进行复苏、传代等操作。将Hela细胞按1×105个接种到10 mm2共聚焦小皿中，待细胞贴壁后，进行实验干预;分别于24 h和48 h用4％多聚甲醛固定后通过TRITC-二抗免疫荧光染色，细胞核用DAPI染色后，在免疫共聚焦显微镜下观察C197蛋白位移情况。 同时将Hela细胞按2×105个接种6孔培养板中，待细胞贴壁后进行实验干预。收集Ad-GFP-C197感染24 h、48h和72 h后的Hela细胞，对照病毒Ad-GFP感染72 h的Hela细胞以及正常的Hela细胞。分别提取总蛋白并调成一致浓度，按照TRAPEZE(R) Telomerase Detection Kit说明书操作;产物行12.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳后用EB溶液染色30min，纯水泡30min后于凝胶成像系统下拍照。 3.hTERT蛋白和NF-κB通路相关因子表达的检测 按常规细胞培养方法对Hela细胞进行复苏、传代等操作。将Hela细胞按2×105个/孔接种到6孔培养板中，待细胞贴壁后进行实验干预。提取各组细胞蛋白后，用免疫印迹法检测hTERT蛋白、P65蛋白和IκBα蛋白表达情况。 4.重组腺病毒Ad-GFP-C197体内对肿瘤的作用 按常规细胞培养方法对Hela细胞进行复苏、传代等操作。取周龄为4-6周的雄性裸鼠在12h日夜交替光照的条件下培养，收集好Hela细胞后与Matrigel调整细胞密度为5×107个/mL，每只裸鼠的右下肢皮下接种0.2 ml Hela细胞。待肿瘤直径达到4-6 mm时，随机分为两组并进行瘤内给药Ad-GFP-C197和Ad-GFP。一周两次，每隔1周测量一次体积，共给药5周。根据每周体积绘制各组肿瘤生长曲线并进行统计学分析。 最后一周将各组肿瘤组织取出并拍照，对其称重后进行统计学分析;4％多聚甲醛固定后用Tunel法检测各组肿瘤组织的凋亡情况;并用免疫组化法检测各组肿瘤组织中P65、IκBα蛋白表达情况。另取一部分组织提取总蛋白行免疫印迹测定C197表达情况。 结论： 1.成功构建了重组腺病毒Ad-GFP-C197，且C197能够在细胞中得到高效表达。 2.依照单因素方差分析结果显示，重组腺病毒Ad-GFP-C197对Hela细胞具有诱导凋亡作用，并明显抑制细胞增殖，在感染后第六天增殖抑制率和细胞凋亡率最大（分别为49.49％和38.07％）。 3.在重组腺病毒Ad-GFP-C197感染后的Hela细胞中观察到C197蛋白能够从细胞质进入到细胞核，也验证了hTERT C端含有核仁定位信号。 4.C197蛋白纯化结果显示出三条蛋白条带，且在分子量大小为25 KDa附近出现一条明显的蛋白条带，进一步验证了C197蛋白表达后的确表达了且大小约为25KDa，同时为C197蛋白纯化提供实验基础。 5.重组腺病毒Ad-GFP-C197能够抑制Hela细胞中端粒酶活性，并且能够下调hTERT蛋白的表达。 6.重组腺病毒Ad-GFP-C197明显抑制Hela细胞中IκBα、P65蛋白的表达水平;提示Ad-GFP-C197的抗肿瘤作用与影响NF-κB通路的活性有关。 7.体内实验结果表明，在肿瘤组织中注射重组腺病毒Ad-GFP-C197，肿瘤组织能表达C197，且Ad-GFP-C197能明显抑制肿瘤组织的生长，促进肿瘤细胞凋亡，下调肿瘤组织中IκBα、P65蛋白的表达。
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