摘要
目的： 1.研究纳米羟基磷灰石珊瑚骨块移植成骨机制和成骨效能。 2.研究血管内皮生长因子对纳米羟基磷灰石珊瑚骨块修复临界慢性下颌骨缺损的促血管和骨组织新生作用。 方法： 1.利用扫描电镜检测商业珊瑚骨块、商业纳米羟基磷灰石珊瑚骨块、人类皮质骨块、人类松质骨块，研究其表面形貌、孔径、微观晶体形态和直径;通过能谱分析检测nHA/coral骨块表面化学元素含量;采用X-射线衍射(X-raydiffraction，XRD)检测和物相分析研究nHA/coral骨块的表面晶相。 2.室温下在超净工作台上将rhVEGF165溶解在无菌PBS缓冲液中，配制成12ug/ml VEGF/PBS溶液。将16块纳米羟基磷灰石/珊瑚骨块独立摆放于无菌培养皿上，将0.25毫升rhVEGF165溶液注射于骨块内（3μg rhVEGF165/骨块），非共价的物理吸附rhVEGF165;将另外16块纳米羟基磷灰石/珊瑚骨块注射等量无菌PBS缓冲液。静置半小时后低温无菌下保存。 3.复合血管内皮生长因子的纳米羟基磷灰石/珊瑚骨块修复临界慢性下颌骨缺损的动物实验 (1)动物实验分为VEGF/nHA/coral和nHA/coral两组，VEGF/nHA/coral组为实验组，nHA/coral组为对照组。每组设3周、8周两个观察时间点。每只动物随机标号，并于每侧下颌骨建立四个标准化临界慢性骨缺损，采用半口对照设计，随机将VEGF/nHA/coral骨块植于一侧缺损中，将nHA/coral骨块植于另一侧。 (2)建立临界慢性下颌骨缺损模型。手术分为两个阶段。首先全麻下采用分根法拔除双侧下颌第二，三，四前磨牙以及第一和第二磨牙(P2-M2)，沿牙槽嵴顶纵向切开粘骨膜，翻瓣，0.9％无菌生理盐水冷却下于双侧下颌骨的颊侧制出四个标准化箱型临界骨缺损(n=8)，大小6×9×12毫米3（颊舌向距离为6mm，牙合龈向距离9mm，近远中向距离为12mm），缺损间隔4毫米;完整保留舌侧骨板，粘骨膜瓣复位，丝线间断缝合。然后，术后8周时，全麻下重新沿牙槽嵴顶纵向切开粘骨膜，翻瓣，对箱型慢性骨缺损进行重新塑形，按照半口对照设计，将16块纳米羟基磷灰石/珊瑚骨块和16块VEGF/纳米羟基磷灰石/珊瑚骨块组分别植入骨缺损内，制作减张切口，粘骨膜瓣复位，丝线间断缝合。 (3)3周、8周处死动物，对骨块及相邻骨组织进行组织学、免疫组织化学观察和组织形态学测量分析。制作脱钙切片，进行HE染色、Masson染色和vWF免疫组化染色，通过HE染色法观察3、8周骨缺损修复中骨细胞、血管和骨基质的生成情况，利用IPP软件测量新生骨面积百分比，对照组和实验组样本量均为8个;通过Masson染色法观察3、8周骨缺损修复中骨胶原基质的分泌情况;利用vWF免疫组化染色法研究血管新生情况，通过IPP软件检测新生血管密度，对照组和实验组样本量均为8个。制作硬组织切片，采用双荧光标记法通过共聚焦显微镜观察不同荧光标记时间点的新骨生成情况以及骨块降解情况，利用IPP软件测量钙化新生骨面积比，对照组和实验组样本量均为8个;通过甲苯胺蓝染色法研究实验组和对照组骨块移植不同观察时间点的新骨生成情况。 4.采用SPSS18.0统计分析软件，对硬组织切片荧光标记的钙化新生骨面积比、脱钙切片HE染色的新生骨面积百分比、vWF免疫组化染色的新生血管密度数据进行统计分析。上述测量结果均以平均值±标准差来表示，首先对组织形态学测量数据进行正态分布和方差齐性检验，若满足正态分布和方差齐则以2×2析因设计的方差分析来检测处理因素的主效应和时间的交互作用。对于单独处理效应的分析，若满足正态分布和方差齐则利用两独立样本t检验进行整体均数的比较;若不满足正态分布或方差不齐则采用两独立样本t'检验比较整体均数。假设检验为双侧检验，检验水准P=0.05。当P＞0.05时，差异被认为无统计学意义;当P＜0.05时，差异被认为具有统计学意义。 结果： 1.coral骨块、nHA/coral骨块、人类皮质骨和松质骨的微观粗糙表面相类似，多孔结构相互连通，其孔径大小在62-164μm范围内;在nHA/coral骨块表面均匀分布着指状的直径为71-99nm的羟基磷灰石晶体，与人类皮质骨和松质骨的纳米级结构非常类似。能谱分析结果显示nHA/coral骨块含有的化学元素主要为钙、碳、氧、磷。XRD检测结果证实nHA/coral骨块的表面晶体成分为羟基磷灰石和碳酸钙。 2.纳米羟基磷灰石/珊瑚骨块具有良好的浸润性，0.25毫升12ug/mlVEGF/PBS溶液恰好完全浸润整个骨块，单个nHA/coral骨块内含3μg rhVEGF165。 3.复合血管内皮生长因子的纳米羟基磷灰石/珊瑚骨块修复临界慢性下颌骨缺损的动物实验 (1)大体观察结果显示: 术后4只比格犬均无死亡，饮食、活动正常，下颌骨移植术区无红肿、化脓，无骨块松动脱落等并发症;3周、8周后，大体标本见植骨区愈合良好，骨生长良好，植骨区与宿主骨边界较清晰。 (2)脱钙切片HE染色组织学观察和组织形态学分析 3周时nHA/coral组在骨缺损区近宿主骨-骨块交界处可见有稀疏骨小梁和伴行的血管结构，并沿着支架向网孔内部生长，骨块内部新骨和血管与界面处相比明显较少，在支架中央几乎无新生组织长入，少见炎症细胞浸润。在新生血管结构中，大量的血管内皮细胞环状排列形成的新生血管和管内的血细胞清晰可见;在新骨小梁结构中还能见沿着脱钙的支架网孔间隙有线形排列的成骨细胞呈多形性，增生活跃。而VEGF/nHA/coral组的新生骨组织结构、分布与nHA/coral组相类似，数量相对较多。8周时随着观察时间的增长，两组新骨和血管生成均明显增多，不仅在骨块的外周可见大量的新生组织，在支架内部很容易发现新生骨组织和血管系统，骨小梁明显增宽，并在局部出现少量的板层骨结构。VEGF/nHA/coral组的支架内的新生组织情况与nHA/coral组相类似，数量相对略多。 组织形态学测量结果显示:nHA/coral组和VEGF/nHA/coral组的新生骨面积百分比分别为21.7±4.6％和27.3±5.8％; nHA/coral组和VEGF/nHA/coral组的新生骨面积百分比分别为32.6±7.2％和39.3±7.8％。析因设计方差分析提示分组与时间之间不存在交互作用（P=0.815），即nHA/coral组与VEGF/nHA/coral组的差异在3w和8w均一样。3周统计数据符合正态分布，Levene's test检查方差齐性;独立样本t检验结果为:t=2.103，P=0.054＞0.05，差异无统计学意义。8周统计数据符合正态分布，Levene's test检查方差齐性;独立样本t检验结果为:t=1.764，P=0.099＞0.05，无显著性差异。在nHA/coral组和VEGF/nHA/coral组内，8周新生骨面积比均显著高于3周，其中nHA/coral组内独立样本t检验结果为:t=3.577，P=0.003＜0.01;VEGF/nHA/coral组内独立样本t检验结果为:t=3.453,P=0.003＜0.01。 (3)脱钙切片Masson染色组织学观察 3周时nHA/coral组，新生骨小梁结构可见新生骨胶原纤维排列稍为紊乱，结构尚未成熟，呈浅蓝色;而VEGF/nHA/coral组新生骨胶原纤维相对成熟，排整齐;类骨质包绕成骨细胞形成骨细胞，形成骨陷窝，有钙盐沉积的骨细胞及骨陷窝结构呈现蓝染。8周时nHA/coral组和VEGF/nHA/coral组均可见蓝色的骨细胞和骨样组织以及成熟的骨性胶原纤维排列整齐而致密，成熟的新生骨组织胶原分布均明显增宽增多，有部分编织骨形成，红蓝相间。 结论： 1.纳米羟基磷灰石珊瑚骨块具有与天然骨组织相似的粗糙表面、化学成分、纳米级微观结构;同时具有理想的三维网孔结构，是符合骨组织工程要求的理想支架材料。 2.纳米羟基磷灰石珊瑚骨块在临界慢性颌骨缺损修复中理想的三维网孔结构可以使细胞能通过网孔结构进入支架内部进而形成血管和骨组织新生，并表现出具有良好的生物相容性、生物降解性、骨诱导性和骨传导性，具有较高的成骨效能。 3.血管内皮生长因子能在骨愈合早期提高纳米羟基磷灰石珊瑚骨块移植的血管新生，促进新骨钙化，但不能在整个骨愈合过程中直接提高新骨生成比例。
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