摘要
目的： 本研究从细胞模型水平，采用分子生物学和生理学的方法，研究MSTN参与COPD骨骼肌功能障碍的发病机制，以及骨骼肌纤维的转换，为进一步阐明COPD骨骼肌功能障碍的发病机制并对其进行治疗提供提供新的思路及策略。再者，证实香烟对骨骼肌的毒性作用，戒烟是防治COPD/肺气肿的重要有效措施，具有重要的临床和社会价值。 方法： 体外培养股四头肌细胞:选鼠龄3～5 d的SD大鼠拉颈处死，取大腿股四头肌肌肉，去脂肪、血液、结缔组织，剪碎1mm3;在体外行骨骼肌原代细胞培养（分别行组织块培养、单层细胞培养），倒置相差显微镜观察细胞形态特征;细胞鉴定:取第3-5代细胞分化成熟后，行苏木素-伊红(HE)染色观察细胞形态特征，以及细胞免疫荧光鉴定;明确贴壁细胞为骨骼肌细胞。 1)实验分组:取第10代以内细胞，当细胞覆盖50％培养瓶时，分别加入含有0％、2.5％、5％、10％ CSE的胎牛血清培养基（香烟提取物统一为使用前30分钟制备），放置培养箱48小时后;随机分四组:正常对照组、2.5％ CSE组、5.0％CSE组、10.0％CSE组。 2)基因水平检测:分别提取四组细胞的RNA，逆转录合成cDNA，实时定量PCR检测MSTN mRNA、MHC-Ⅰ mRNA、MHC-Ⅱ A mRNA、MHC-ⅡB mRNA的表达。 3)蛋白水平检测:分别提取四组细胞的蛋白，煮沸变性，电泳、电转，Westernblotting检测MSTN蛋白的表达。 4)统计学方法:计量资料以（(X)±s）表示，多组间比较采用单因素one-wayANOVA方差分析检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。 结果： (1)体外成功原代培养SD大鼠骨骼肌细胞:SD大鼠骨骼肌细胞在倒置显微镜下观察可见，骨骼肌细胞刚铺板于胎牛血清培养基时细胞呈圆形，形态均一，折光性强，悬浮于培养基中;5～6h后开始贴壁，24 h后完全贴壁，并开始增生，细胞逐渐延伸成梭形，相互融合，按一定方向有序排列。随细胞密度的增加，细胞逐渐有规律地平行排列;培养至2～3 d时细胞分化达到高峰，随后逐渐开始凋亡、漂浮。HE染色可见细胞核呈扁椭圆形，染成蓝色，符合骨骼肌细胞的形态学特点;细胞免疫荧光检查提示90％以上的细胞呈阳性反应，细胞核染成蓝色，符合骨骼肌细胞的表型特征。 (2)MSTN mRNA实时定量PCR检测结果显示:4组MSTN mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义(P＜0.05);其中，5.0％组、10.0％组MSTN mRNA相对表达量高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05);伴随CSE的浓度升高，目标基因表达越高。支持当初的实验设想，MSTN随CSE的浓度升高，表达越高，(P＜0.05）。 (3)MHC-Ⅰ mRNA实时定量PCR检测结果显示:4组MHC-ⅠmRNA相对表达量比较，差异有统计学意义(P＜0.05);其中，5.0％组、10.0％组MHC-ⅠmRNA相对表达量低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05);伴随CSE的浓度升高，目标基因表达越低。支持当初的实验设想，MHC-Ⅰ随CSE的浓度升高，表达越低，（P＜0.05）。 (4)MHC-ⅡA mRNA实时定量PCR检测结果显示:4组MHC-ⅡA mRNA相对表达量比较，其中，2.5％组、5.0％组、10.0％组MHC-ⅡA mRNA相对表达量低于对照组，只有2.5％组差异有统计学意义(P＜0.05);而5.0％组、10.0％组差异无统计学意义(P＞0.05)。 (5)MHC-Ⅱ BmRNA实时定量PCR检测结果显示:经3次更换MHC-ⅡB的引物，反复实验，均未能作出扩增曲线及溶解曲线。 (6)MSTN蛋白Western blotting检测结果显示:4组MSTN蛋白表达水平比较，差异有统计学意义(P＜0.05);其中，5.0％组、10.0％组MSTN蛋白表达水平高于对照组和2.5％组，差异有统计学意义(P＜0.05）;伴随CSE的浓度升高，目标蛋白表达越高。支持当初的实验设想，MSTN随CSE的浓度升高，表达越高，(P＜0.05)。 结论： 1、香烟提取物可致体外骨骼肌细胞变形、凋亡，浓度越高、刺激时间越长，表现越明显。 2、香烟提取物刺激骨骼肌细胞内肌肉生长抑制素的mRNA基因及蛋白水平升高，其水平随CSE浓度的升高而升高，提示吸烟可导致骨骼肌功能障碍、萎缩。 3、香烟提取物刺激骨骼肌细胞后，MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ AmRNA基因表达水平下降，吸烟可导致MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ型骨骼肌纤维减少。
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