摘要
细粒棘球蚴病，或称囊型包虫病，是由细粒棘球蚴（Echinococcus granulosusis）所引起的一种人畜共患性寄生虫病。在我国感染细粒棘球蚴的动物当中，羊的感染情况最严重。但临床应用中，对细粒棘球蚴病的不同诊断方法，依然存在各自的缺陷。因此，本研究的目的在于建立一种快速、简便、准确的利于基层诊断的羊细粒棘球蚴检测方法。 本研究对细粒棘球蚴HSP70(Heat shock protein70)蛋白进行了克隆及原核表达，根据GenBank中的细粒棘球蚴hsp70基因序列，用Primer5软件设计了特异性引物，以细粒棘球蚴基因组为模板，扩增hsp70片段，将该基因片段克隆至pMD18-T Vector并至感受态大肠杆菌TOP10，再用PCR及酶切鉴定。经过测序鉴定，得到了大小为957bp的目的片段，与GenBank中的序列相比，两者相似性为99.4％。然后将该片段和表达载体pET30a分别用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定，构建了表达载体pET30a-hsp70，将其转化至大肠杆菌BL21，用IPTG诱导表达，表达产物经过SDS-PAGE分析显示，细粒棘球蚴HSP70的原核表达成功，蛋白约为43 kDa。接着用纯化蛋白免疫新西兰雄性白兔，第二、第三次免疫后一周采血、析出血清，并进行抗体效价测定，判断免疫效果;第四次免疫后一周大量采血、析出血清，进行抗体效价及特异性检测，最终获得效价为＞1∶51200的多抗。同时，本研究制备了直径约为15nm的胶体金颗粒，以胶体金标记HSP70，制备胶体金试纸条，建立了一种细粒棘球蚴的快速检测方法。该方法可在20 min内得到检测结果，400～500倍稀释待检血清得到的显色条带最明显，并且在阳性羊血清稀释到1000倍依旧可以观察到阳性条带，与感染肝片吸虫、捻转血矛线虫、小反刍兽疫、口蹄疫的羊阳性血清不发生交叉反应，且试纸条在4℃保存8个月后依然具有较高的检测效果。本研究中采集了来自浙江省杭州、温州、丽水、舟山、台州、衢州、金华、湖州、嘉兴、绍兴、宁波11个地区养殖场的728份羊血清样品，并应用建立的胶体金免疫层析检测方法对血清样品进行检测，发现样品中呈阳性的有19份，浙江省这11个地区的总检测阳性率为2.61％。对羊血清样品的检测数据进行统计学分析，结果显示浙江省部分地区羊的细粒棘球蚴感染明显少于西北地区，提示在浙江省地区对该病的防治工作做得相对较好。 综上所述，本研究基于细粒棘球蚴hsp70基因建立了一种可靠的胶体金试纸条检测方法，运用该方法对浙江省11个地区养殖场的羊血清样本进行检测，并对试验数据进行统计学分析。初步应用结果说明，该试纸条具有良好的应用前景。
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