摘要
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科，单链、环状DNA病毒。包括无致病性的猪圆环病毒1型(PCV1)和具有致病性的猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV2不仅可以引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，还与猪皮炎肾病综合症(PDNS)、猪呼吸道疾病综合症(PRDC)、增生性坏死性肺炎(PNP)以及繁殖障碍等疾病的发生有关。PCV的大规模流行给世界各国的养殖企业带来了严重的经济损失，尽管研究者已经研发出了PCV的各种检测方法，但这些方法大多需要昂贵的设备和专业的操作技术人员，不适用于基层单位的大规模推广和使用。本论文基于胶体金免疫层析原理，对PCV2抗原、抗体检测方法进行了相关研究。 使用胶体金标记PCV2-dCap蛋白，PCV2-dCap蛋白包被检测线，识别PCV2-dCap蛋白抗原表位的单克隆抗体5E11包被质控线。同时对蛋白标记pH、标记量、金标垫处理液PVP浓度、蛋白保护剂种类、表面活性剂浓度、样品垫处理液种类、金标浓缩倍数、检测线点膜浓度、质控线点膜浓度、样品稀释倍数、最佳读数时间等参数进行了选择和优化。结果显示，PCV2-dCap蛋白最佳标记pH为7.5，最佳标记量为70μg/mL胶体金，金标垫处理液PVP浓度为1％，蛋白保护剂为30％蔗糖和1％BSA，样品垫处理液选用1％酪蛋白。金标液三倍浓缩，检测线点膜浓度为0.5mg/mL，质控线点膜浓度为0.6mg/mL。待检样品直接检测，结果判定的最佳时间范围为10-30min。该方法同伪狂犬、蓝耳、猪瘟、甲流(H3N2)等病毒的阳性血清无交叉反应性。该方法检测PCV2 Cap蛋白单抗5E11、8A12，PCV2 Cap蛋白兔多抗，PCV2感染猪多抗的极限分别为0.61μg/mL、200μg/mL、12.5μg/mL、225μg/mL。该方法同ELISA总符合率为99.58％。试纸条批内差异变异系数小于2.5％，批间差异变异系数小于7.6％。试纸条存放9个月后敏感性略有下降。 构建了含PCV2-Rep5'端366bp截短片段的重组表达载体pGEX-4T1-PCV2-Rep1，并在宿主菌表达。使用胶体金同时标记PCV2-Rep1、PCV2-dCap蛋白，PCV2-Rep1蛋白包被检测线，识别PCV2-dCap蛋白抗原表位的单克隆抗体5E11包被质控线，同时对试纸条制备的各种参数进行了优化。结果显示，PCV2-Rep1在宿主菌中以可溶性形式大量表达，PCV2-Rep1蛋白最佳标记pH为7.5，最佳标记量为70μg/mL胶体金，PCV2-dCap蛋白的标记量为50μg/mL。金标液三倍浓缩，检测线点膜浓度为0.8mg/mL，质控线点膜浓度为0.6mg/mL。待检样品直接检测，结果判定的最佳时间范围为10-30min。该方法同伪狂犬、蓝耳、猪瘟、甲流(H3N2)等病毒的阳性血清无交叉反应性。该方法检测PCV2 Rep蛋白单抗2H10，PCV2感染猪多抗的极限分别为600μμg/mL、425μg/mL。该方法同Rep抗体检测ELISA的总符合率为94.6％。试纸条批内差异变异系数小于8.3％，批间差异变异系数小于8.7％。试纸条4℃存放6个月后敏感性无明显变化，常温存放略有下降。 使用胶体金同时标记PCV2猪多抗和识别PCV2-dCap蛋白抗原表位的单抗5E11，猪多抗包被检测线，PCV2-dCap蛋白包被质控线，同时对试纸条的各种参数进行了优化。结果显示，PCV2猪多抗最佳标记pH为8.5，最佳标记量为110μg/mL胶体金，5E11的标记量为50μg/mL胶体金。金标液五倍浓缩，检测线点膜浓度为2.5mg/mL，质控线点膜浓度为0.3mg/mL。待检病毒液直接检测，结果判定的最佳时间范围为10-30min。该方法同伪狂犬、蓝耳、猪瘟、甲流(H3N2)等病毒无交叉反应性。病毒液的检测下限为10-6.8 TCID50/mL，原核表达蛋白PCV2-dCap的检测下限为30μg/mL。试纸条批内差异变异系数小于8.3％，批间差异变异系数小于8.7％。试纸条在存放三个月后，其敏感性无明显变化。
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