摘要
牙鲆弹状病毒（Hirame rhabdovirus，HRV）是弹状病毒科粒外弹状病毒属新成员，具有强烈的致病性，给全球海水养殖业造成了严重的经济损失。病毒在入侵宿主细胞的过程中，宿主细胞通过模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs）监测病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs）而感知病毒的入侵，并通过信号通路的级联传递，协调病毒感染早期宿主反应，并随即激活宿主获得性免疫反应。然而，通过和宿主的相互作用，RNA病毒进化出逃逸宿主 RLRs免疫监视的不同策略来干扰宿主 RLRs抗病毒信号，阻断 RLRs信号的传导，从而导致宿主发病。多数情况下，病毒倾向于利用非结构蛋白进行此功能。而HRV致病机制及逃逸宿主免疫监视的分子机制还没有得到明确的阐述。 本研究根据GenBank中HRV中国株全长基因序列设计特异性引物，用RT-PCR方法从病毒悬液中分段扩增HRV全长基因组序列，得到的基因序列拼接后，经BLAST比对发现与中国株的同源性达到99.77%，为后续获得感染性克隆奠定基础。 根据GenBank中HRV中国株非结构蛋白（Non-virion perotein，NV）基因序列设计特异性引物，用RT-PCR方法扩增NV基因，鉴定无误后连接到大肠杆菌pColdⅠ载体中，构建的重组表达质粒pColdⅠ-NV在大肠杆菌BL21（T1?）宿主菌中获得高效表达，表达产物以可溶性蛋白存在。经Ni-NTA亲和层析柱纯化获得有活性的NV蛋白。以浓缩纯化的HRV作为抗原免疫Balb/c小鼠，得到效价为1:51200的抗HRV多克隆抗体。Western-blot和ELISA试验结果表明，抗HRV多克隆抗体能特异性识别表达获得的HRV NV重组蛋白，证明NV重组蛋白抗原性良好。本实验成功获得有活性的NV蛋白，为研究牙鲆弹状病毒逃逸宿主免疫监视的机制奠定了实验基础。
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