摘要
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是危害人类健康的重大疾病，炎症反应是 COPD重要的发病机制，阻抑炎症反应是改善COPD症状、延缓疾病进程的重要途径。COPD的炎症反应涉及多种细胞及多个信号通路，其中肺泡上皮细胞在其中起到重要作用，核转录因子-κB（NF-κB）信号通路的活化是导致炎症介质过度表达、参与炎症反应的机制之一。因此，阻抑NF-κB信号通路是抑制肺部炎症反应、治疗COPD的重要途径。本文就调补肺肾三方对肺泡上皮细胞 A549中NF-κB信号通路的调控进行观察，探讨中医药抑制COPD炎症反应的分子生物学机制。 目的:观察调补肺肾三方（补肺健脾、补肺益肾、益气滋肾）对 A549中NF-ΚB信号通路的调控作用，为揭示调补肺肾三方抑制COPD炎症反应的作用机制提供依据。 方法:SPF级SD大鼠60只随机分为正常对照组、补肺健脾组、补肺益肾组和益气滋肾组。分别用生理盐水、补肺健脾方、补肺益肾方、益气滋肾方灌胃，于第7次灌胃后1h腹主动脉采血，离心分离血清，-70℃保存所得含药血清。制备香烟烟雾提取物（CSE），并摸索最佳储备条件。不同浓度（40%，20%，10%，5%，2.5%）CSE刺激肺泡上皮细胞A549不同时间（6h，12h，24h，48h），MTT法检测对细胞的增殖和抑制情况；ELISA法检测其上清中白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子的分泌情况；western blot法检测细胞中核因子-κB（NF-κB）、核抑制因子-κBα(IκBα)、髓样分化因子88（Myd88）蛋白表达。根据结果选取体外炎症模型最佳条件。分组干预细胞：分为正常组、模型组、空白血清组、补肺健脾血清组、补肺益肾血清组、益气滋肾血清组，每组血清又分为高（20%）、中（10%）、低（5%）三个浓度，选取上述相同指标进行测定。之后添加 PDTC组，分三个浓度（25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L），凝胶迁移率实验（EMSA）检测细胞中NF-κB活性。 结果: 1.CSE的储备条件:香烟烟雾提取物CSE不同时间（0h、6h、12h、24h、48h）不同保存条件（室温、4℃、-20℃）不同波长（236nm、259nm、282nm、320nm）避光下吸光值有变化。与0h比较，室温下CSE在236nm处6h、12h、24h的OD值有变化，259nm处12h的OD值有变化；4℃下236nm处6h、24h的OD值有变化，259nm处6h的OD值有变化；-20℃下236nm处12h、24h、48h的OD值有变化。与6h比较，4℃下259nm处12h、24h的OD值有变化。与12h比较，4℃下259nm处48h的OD值有变化。余各时间点间OD值变化无明显统计学意义。 2.细胞形态与数量:高浓度（40%-10%）CSE使细胞形态发生改变：细胞变小、胞质粗糙；低浓度（5%-2.5%）CSE对细胞形态影响较小。各浓度CSE对细胞生长均呈抑制作用；抑制率与浓度呈正相关，见表7；20%、5%、2.5%浓度下抑制率与作用时间呈负相关，其余浓度下抑制率与时间无相关。 3.各组细胞中细胞因子表达 3.1 CSE对细胞因子的影响:正常组与各CSE组分泌IL-6、IL-8在48h时达分泌高峰；10%CSE组、2.5%CSE组分泌IL-10在48h时达分泌高峰，5%CSE组分泌 IL-10在48h时分泌最少；各组细胞分泌TNF-α与作用时间无明显关系。在48h时，与正常组比较，2.5%CSE组与10%CSE组分泌IL-6降低，5%CSE组与20%CSE组分泌IL-6升高；2.5%CSE组分泌 IL-8降低，但无显著统计学差异，5%CSE组分泌 IL-8升高，10%CSE组分泌 IL-8升高，但无显著统计学差异，20%CSE组分泌IL-8降低；各CSE组分泌 IL-10均升高，其中5%CSE组升高最少，10%CSE组升高最多；2.5%CSE组、5%CSE组、10%CSE组分泌TNF-α稍升高，20%CSE组分泌TNF-α稍降低，但各组均无显著统计学差异。5%CSE组分泌IL-6、IL-8水平显著高于其它 CSE组；5%CSE组分泌 IL-10水平显著低于其它CSE组。 3.2调补肺肾三方对细胞因子的影响:补肺健脾血清组、补肺益肾血清组和益气滋肾血清组分泌IL-6、IL-8较空白血清组明显减少，其中补肺益肾血清组降低最为显著；补肺健脾血清组和益气滋肾血清组分泌IL-10升高，补肺益肾组分泌IL-10降低，但无显著统计学差异。 4.各组细胞中Myd88、IκBα、NF-κBp65蛋白表达 4.1 CSE对蛋白表达的影响:模型组 Myd88、IκBα、NF-κBp65蛋白表达水平均较正常组显著升高。 4.2调补肺肾三方对蛋白表达的影响:补肺益肾血清组（20%，10%）、补肺健脾血清组（20%，10%）、益气滋肾血清组（20%）表达Myd88较空白血清组降低；补肺益肾组（10%）表达IκBα较空白血清组降低；补肺益肾组（20%）、补肺健脾组（20%，10%）表达NF-κBp65较空白血清组降低；各5%血清组对三种蛋白表达无明显统计学意义；20%血清组明显低于10%血清组及5%血清组。 5.各组细胞中NF-κB活性表达:CSE刺激的细胞与NF-κB探针的结合增强；补肺益肾方、补肺健脾方、益气滋肾方血清及PDTC干预后的细胞与NF-κB探针结合减弱，NF-κB活性下降。 结论: 1.储备后的CSE与新鲜制备的CSE相比 OD值发生改变，建议使用新鲜制备的CSE。 2.烟雾提取物刺激可使肺泡上皮细胞A549生长受到抑制，能刺激细胞分泌炎症因子增加，可使用CSE刺激建立细胞炎症反应模型。 3.确定了模型制备的关键条件，建议选用5%浓度CSE作用肺泡上皮细胞48h来建立细胞炎症模型。 4.调补肺肾三方可通过下调相关细胞因子表达水平，调节 NF-κB信号通路以抑制COPD炎症反应。 5.补肺健脾方、补肺益肾方和益气滋肾方中补肺益肾方在下调细胞因子水平及抑制蛋白表达方面作用更为突出，且高浓度（20%）在抑制IκBα、Myd88表达方面效果更佳；补肺健脾方在抑制NF-κB活性方面作用较为突出。
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