摘要
目的：棉花枯萎病是影响海岛棉产量和品质的最重要的病害，由于海岛棉中缺乏高抗枯萎病的资源，因此从枯萎病抗性资源丰富的陆地棉中克隆抗病相关基因，利用转基因技术改良海岛棉抗病性是解决海岛棉枯萎病的有效途径，而植物转录因子在抗病信号途径中处于枢纽地位，如WRKY转录因子具有高度保守的DNA结合域——WRKY结构域，即在病原物、化学物质或外界损伤的诱导条件下，WRKY蛋白的 WRKY结构域能专一地识别并结合目的基因上游启动子中的 W-box序列（C/TTGACT/C），调控下游基因如病程相关蛋白基因的转录过程，从而改变植物抗病、抗逆性状，在植物抵抗生物和非生物胁迫中扮演重要角色。本研究以枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱中筛选得到WRKY基因片段为探针，结合生物信息学方法，从陆地棉中克隆抗枯萎病相关的WRKY转录因子，并初步研究其功能，为海岛棉抗枯萎病分子育种奠定基础。 方法：以高抗枯萎病的陆地棉“中棉所12”为实验材料，以枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱中筛选得到WRKY基因片段为探针，利用电子克隆结合RT-PCR技术，从陆地棉“中棉所12”根部cDNA中克隆与抗枯萎病相关WRKY转录因子基因GhWRKY44、GhWRKY22；利用qRT-PCR技术分析GhWRKY44、GhWRKY22基因在棉花枯萎病菌、ET、SA和JA胁迫下的表达模式；构建GhWRKY44、GhWRKY22基因的植物过表达载体，利用农杆菌介导法和农杆菌侵染花柱头法分别转化烟草和海岛棉，初步研究基因的功能。 结果：⑴从抗枯萎病的陆地棉品种“中棉所12”中克隆了2个抗枯萎病相关的WRKY转录因子基因GhWRKY44（登录号：KJ801807）与GhWRKY22（登录号：KJ801808）。GhWRKY44的开放阅读框为1197bp，编码398个氨基酸，编码的氨基酸中含有两个典型的WRKY结构域，锌指结构为C2H2型，属于WRKY家族I类；GhWRKY22的开放阅读框为686bp，编码228个氨基酸，氨基酸中含有一个典型的WRKY结构域，锌指结构为CX4-5CX22-23HX1H（X为任意氨基酸），同源分析表明，该基因属于WRKY家族II类e亚族。⑵利用生物信息学软件对GhWRKY44和GhWRKY22基因编码的蛋白质理化性质分析表明，GhWRKY44基因编码的蛋白分子量为44.24kD，理论等电点为8.80，为亲水蛋白，GhWRKY22基因编码的蛋白分子量为25.47kD，理论等电点为9.65，为亲水蛋白。GhWRKY44和GhWRKY22基因编码的蛋白质无规则卷曲是该蛋白二级结构的主要组成元件，均存在核定位信号序列（KRKK/KRRK），核定位预测分析该基因可能位于细胞核中。⑶qRT-PCR分析发现：感病品种与抗病品种经棉花枯萎病菌诱导后，GhWRKY44和GhWRKY22基因在抗病品种中的表达量明显高于感病品种，对于病原菌的响应时间要早于感病品种。分别用SA、JA和ET处理抗病品种“中棉所12”棉苗后，ET处理后，GhWRKY44和GhWRKY22基因的表达量变化不明显，SA和JA均能够诱导GhWRKY44和GhWRKY22基因的表达。SA处理后，GhWRKY44基因的表达量迅速增加，随处理后时间的推移，其表达量一直维持在一个较高的水平，处理后24h表达量达到最高；JA处理后，该基因的表达量呈现先增加后降低的变化趋势，处理后4h其表达量达到最高值，但其表达水平明显低于SA处理。JA与SA处理后，GhWRKY22基因呈现先升高然后下降的趋势，相对处理前也有明显变化，随时间的延长，JA与SA1h表达量最高；但二者在7个处理时间点的平均相对表达量相差不大。⑷构建基因（GhWRKY44和GhWRKY22）植物过表达载体，通过农杆菌介导法将目的基因转入烟草，从两个转基因后代各选取5株进行RT-PCR检测，10株均为阳性株，说明GhWRKY44和GhWRKY22基因不仅整合到烟草基因组中而且还能正常转录。对过表达GhWRKY44/GhWRKY22基因的转基因烟草T1代株系进行qRT-PCR分析，结果表明，在正常生长情况下，PR5和NPR1的表达量在转GhWRKY44株系中明显增加，PR1a、PR2、PR5和NPR1的表达量则在转GhWRKY22株系中均高于野生型株系。枯萎病菌侵染后，在转GhWRKY44株系中，PR1a、PR2和NPR1的表达量迅速增加，明显高于野生型株系，在转GhWRKY22株系中，PR1a、PR5和NPR1的表达量明显高于野生型株系；而PR2的表达量则低于野生型株系，尤其是PR1a，在枯萎病菌处理后24小时内，在转GhWRKY44和GhWRKY22株系中，5个处理时间点的平均表达量与野生型相比约增加了60/45倍；⑸在田间利用农杆菌侵染花柱头法将GhWRKY44和GhWRKY22导入棉花，经PCR检测，转GhWRKY44基因阳性株有9株，转GhWRKY22基因阳性株有4株，说明GhWRKY44和GhWRKY22基因整合到棉花基因组中。 结论：研究表明，GhWRKY44和GhWRKY22是与枯萎病抗性有关的WRKY转录因子基因，这两个基因可能参与了棉花对病原菌、激素胁迫的应答响应；构建过表达载体（pPZP35S-GhWRKY44和pPZP35S-GhWRKY22），利用农杆菌介导法将GhWRKY44/GhWRKY22转入烟草，并获得转基因烟草，该目的基因能在烟草中异位表达并能激活病程相关蛋白基因的表达，但其功能仍需进一步的研究。利用农杆菌侵染花柱头法进行田间海岛棉转化，为进一步探索该目的基因的功能奠定基础。
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