摘要
【背景】 随着经济高速发展和生活方式的快速转变，糖尿病在中国不仅发病率高，而且处于快速增长阶段。最新调查表明目前中国糖尿病患者有9千多万，准糖尿病患者已达1亿4千多万。代谢紊乱导致的糖尿病血管并发症，是糖尿病患者致死、致残的主要原因。如何有效预防和治疗糖尿病血管并发症的发生与发展，成为亟待解决的问题。 内皮的再生减弱和血管新生受损导致了糖尿病微血管和大血管的并发症。内皮细胞的功能障碍是糖尿病血管病变的关键和始动因素。自从1997年,Asahara等首次证明循环外周血中存在能分化为血管内皮细胞的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs），越来越多的研究证明EPCs具有修复血管内皮和维持血管完整性的作用，并且在血管新生中发挥重要作用。而大量研究发现糖尿病患者EPCs数量减少，增殖减弱、黏附和血管形成能力明显下降。EPCs功能障碍在糖尿病血管并发症的发生发展中具有重要作用。然而有关糖尿病 EPCs数量减少和功能障碍的机制尚不清楚。因此进一步阐明糖尿病EPCs功能障碍的机制，找到改善EPCs功能的策略，有望成为预防和治疗糖尿病血管并发症的有效策略。 Hedgehog信号通路在胚胎发育期调节细胞的分化、组织的形成和器官的发生，在出生后及成年期可维护组织的稳态及受损后的修复及再生。许多的研究表明Hedgehog信号通路可以促进多种组织中血管的生长，缺血损伤时激活Hedgehog通路可促进血管新生的生成过程。而且近年的一些研究发现在糖尿病动物模型中，激活Hedgehog信号通路可改善多种糖尿病的并发症。我们之前的研究也证实在糖尿病伤口表面给予Sonic hedgehog（Shh）蛋白治疗后，可以促进糖尿病皮肤伤口的愈合。并且在1型糖尿病小鼠心肌梗死模型中，给予Shh信号通路受体激动剂，能显著改善心肌梗死后的心脏功能。然而Shh信号通路改善糖尿病并发症的机制不明，有待进一步研究。 因此我们提出以下研究设想：Shh信号通路通过改善EPCs的功能障碍，促进糖尿病血管新生，进而改善糖尿病并发症。EPCs的功能障碍与Shh信号通路受损有关。 本课题以1型糖尿病小鼠和糖尿病小鼠下肢缺血为实验模型，分离培养糖尿病EPCs，从体内和体外探讨了糖尿病EPCs的Shh通路受损，激活Shh通路通过改善糖尿病EPCs功能障碍，增加EPCs动员，促进糖尿病的血管新生，进而改善糖尿病并发症，并初步探讨了糖尿病EPCs的Shh通路受损的机制。为糖尿病血管病变的治疗提供新的理论依据和治疗策略。 第一部分Sonic hedgehog促进1型糖尿病小鼠血管新生的研究 目的 探讨Shh对1型糖尿病小鼠血管新生的作用。探讨Shh对1型糖尿病小鼠EPCs动员和功能的作用。 方法 建立1型糖尿病小鼠模型，用血糖和体重指标观察糖尿病小鼠成模情况。在糖尿病7周制作小鼠下肢缺血模型进行实验。在小鼠下肢缺血手术后立即药物干预，分别给予 Shh信号通路受体激动剂 SAG（5mg/kg/d）和拮抗剂 SANT（3.3mg/kg/d），每天一次，并持续至实验结束。在下肢缺血手术后第1天、7天和14天用激光多普勒血流仪检测各组小鼠下肢的血流灌注情况；应用免疫荧光方法检测毛细血管密度；流式细胞术检测小鼠外周血EPCs数量；并采用密度梯度法分离培养各组小鼠的内皮祖细胞进行实验，用免疫荧光鉴定EPCs；Transwell法检测EPCs的迁移能力；Matrigel法检测EPCs的小管形成能力；Western-blot方法检测Shh信号通路中Shh，Ptc1和Gli1的蛋白表达水平。 结果 1.成功建立1型糖尿病小鼠模型，从第1周开始1型糖尿病小鼠血糖显著升高，体重降低，一直持续实验结束。 2.在糖尿病7周制作下肢缺血模型，1型糖尿病小鼠下肢的血流灌注恢复比正常对照小鼠显著延迟，Shh通路受体激动剂SAG治疗可明显改善糖尿病小鼠后肢的血流灌注。拮抗剂SANT-1则进一步减少血流灌注。 3.糖尿病小鼠下肢缺血处的新生血管密度比正常对照组明显减少。而SAG治疗组小鼠血管密度比糖尿病小鼠增多。 4.糖尿病小鼠外周血EPCs动员数量明显少于正常对照小鼠。激动剂SAG增加糖尿病小鼠外周血EPCs动员，给予拮抗剂SANT-1的糖尿病小鼠外周血EPCs动员数量比糖尿病小鼠更少。 5.1型糖尿病小鼠体内给予激动剂SAG后，受损的内皮祖细胞的迁移和小管形成能力得到改善。 6.糖尿病小鼠EPCs的Shh通路受损，给予激动剂SAG可部分上调受损的通路。 小结 1.1型糖尿病小鼠的血管新生受损，Shh通路激活剂 SAG可以促进糖尿病小鼠的血管新生，部分恢复糖尿病小鼠的血流灌注。 2.体内给予Shh通路激动剂SAG可增加1型糖尿病小鼠EPCs动员，改善糖尿病小鼠EPCs功能障碍。 3.糖尿病小鼠EPCs的Shh信号通路下调，体内给予激动剂SAG可上调受损的通路。 第二部分Sonic hedgehog改善1型糖尿病小鼠内皮祖细胞功能的研究 目的 观察1型糖尿病小鼠EPCs的功能改变，和激活Shh通路对糖尿病EPCs功能的改善作用。并探讨糖尿病小鼠EPCs的 Shh通路下调的机制。 方法 1.建立1型糖尿病小鼠模型。在糖尿病第7周采用密度梯度法分离并培养糖尿病小鼠和正常对照小鼠的内皮祖细胞进行实验。给予 Shh通路配体蛋白Shh和受体激动剂SAG，用MTT法检测EPCs的增殖能力；Transwell法检测EPCs的迁移能力；Matrigel法检测EPCs的小管形成能力；β-半乳糖苷酶染色检测EPCs的衰老。 2.分离培养小鼠的内皮祖细胞进行实验。给予糖基化终末产物AGEs；给予Shh通路受体激动剂 SAG，AKT抑制剂 LY294002，蛋白酶体抑制剂 MG132和GSK-3β抑制剂LiCl，Western-blot方法检测Shh信号通路中Gli1和Gli2的蛋白表达水平和AKT/GSK3β信号通路中AKT和GSK3β的活性。 结果 1.1型糖尿病小鼠与正常对照组相比，EPCs功能下降，体外给予Shh信号通路蛋白 Shh和受体激动剂SAG，可增加糖尿病 EPCs增殖，改善迁移和小管形成能力，减少衰老。 2.晚期糖基化终产物（AGEs）可使EPCs的Shh信号通路蛋白Shh、Ptc1蛋白表达下降。 3.1型糖尿病小鼠EPCs中的AKT活性下降，GSK-3β活性升高。 4.给予AKT抑制剂LY294002，使SAG激活的EPCs的Shh通路蛋白Gli1,特别是Gli2表达明显下降。而再同时给予蛋白酶体抑制剂MG132，Shh通路蛋白Gli1，Gli2表达回升。体外给予GSK-3β抑制剂LiCl，EPCs的Shh通路蛋白表达增加。 5.体外给予Shh信号通路激动剂SAG，EPCs中的AKT活性增强。 6.给予AKT抑制剂LY294002，使SAG诱导的EPCs小管形成和迁移减弱。 小结 1.1型糖尿病小鼠EPCs功能受损，激活Shh通路，可改善糖尿病小鼠EPCs功能：EPCs增殖增加，小管形成能力和迁移能力增强，且衰老减少。 2.糖尿病EPCs的AKT活性下降导致其下游GSK3β活性增高，进而使Shh信号通路受损。AKT活性下降抑制Shh通路激动剂SAG诱导的EPCs的小管形成和迁移。 1.糖尿病小鼠的EPCs功能障碍，Shh信号通路下调，激活Shh通路可改善糖尿病EPCs的功能。 2. Shh通路激动剂SAG通过改善EPCs的功能和增加EPCs动员，促进糖尿病小鼠血管新生。 3.糖尿病EPCs的PI3K/AKT信号通路下调使其下游GSK3β活性增高，导致Shh信号通路受损。
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